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纤维素被认为是广泛存在的可再生资源,预计未来将取代液体燃料。木质纤维素水解的单糖是重要的原料,因为这些混合单糖可用于各种生产过程,包括生产乙醇燃料。然而,纤维素高聚合度结晶结构具有天然抗性,因此难以进行物理或化学降解。其中,木质纤维素中木质素和半纤维素的存在也限制了它的降解。木质纤维素的降解过程是多种酶协同的过程。近年,发现一种能促进纤维素酶活性的蛋白,称为增效蛋白,其中Expansin家族和Expansin like家族引起许多研究者的关注。Expansin首先在黄瓜下胚轴中发现,并具有松弛细胞壁的功能,自身却不能水解纤维素。Expansin是一类基因超家族,其编码约25KDa的蛋白质。近年来,在细菌和真菌中发现了大量的Expansin like蛋白。枯草芽孢杆菌是第一种发现含有Expansin like的微生物,这种增效蛋白与纤维素酶具有协同作用,能大大提高纤维素酶水解的效率。由于微生物是工业生产最理想的生物,所以,本研究目的是从细菌中发现含有潜在增效蛋白的新菌种。 首先,以枯草芽孢杆菌Expansin like序列(gi|2619024|gb|AAB84448.1| YoaJ[Bacillus subtilis])为模版,初步找到大量的Expansin like同源序列,再根据这些同源序列找到这类蛋白高度保守的motifs,最后以motifs找到含有潜在增效蛋白的新菌种。运用同源建模的方法对新菌种氨基酸序列进行建模,与蛋白数据库中的Expansin like蛋白模型进行三级结构比对,确定含有相似的结构。经过整理分析获得Sterptomyces ipomoeae; Corallococcus coralloides; Saccharothrixsyringae; Cystobacter violaceus; Methylibium sp.CF059; Acidovorax radicis6种含有潜在增效蛋白的菌种。 根据比对结果从普通微生物保藏中心购买甘薯链霉菌菌株,根据序列特异性设计引物。提取番薯链霉菌总基因组,进行PCR扩增,序列长672bp,凝胶回收扩增片段,提取pET-28a(+)和pET-32a(+)质粒与回收的目的片段进行双酶切,回收双酶切片段在T4连接酶的体系下连接,形成重组质粒,热激转化入E.coliDH5α,平板涂布后挑选单菌落,送去测序。分析测序结果确定正确重组质粒,提取质粒分别转化入感受态细胞E.coli BL21和E.coli Rosetta(DE3),平板涂布挑选单菌落,测序获得重组表达菌。 增效蛋白在大肠杆菌系统中正常条件表达时,出现了包涵体,在表达温度从28℃降低至16℃,转速由180rpm降至100rpm后,蛋白表达速率降低,包涵体的量大大减少,SDS-PAGE电泳中可溶的目的蛋白条带变得明显清晰。根据重组蛋白His标签的特性,运用梯度纯化的方法,进行Ni柱洗脱纯化,运用实验室滤纸酶解体系,测得Sip1-pET32a(+)和Sip1-pET28a(+)重组菌表达粗蛋白的增效活性分别是32.3%和35.3%。