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目的:急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)极易进展为慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)及终末期肾病(end stage renal diseases,ESRD),其发病率和病死率不断提高,给家庭和社会造成巨大伤害。肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是导致 AKI的重要原因,也是肾移植术后影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素之一。RIRI发病机制复杂,其病理特征主要表现为肾小管上皮细胞损伤和死亡。细胞凋亡是缺氧诱导肾小管上皮细胞死亡的主要机制之一。自噬参与调控缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)中氧化应激导致的细胞凋亡,在RIRI的发生发展过程中起到关键性的调控作用。全面深入研究RIRI中小管上皮细胞自噬和凋亡之间的交互作用机制,将为RIRI引起的AKI等疾病的认知及防治带来突破性进展。本研究将着重探析自噬相关蛋白粘着斑激酶家族相互作用蛋白FIP-200(fak-family interacting protein of200 kDa,FIP200)在肾 IRI 中的作用及其与自噬、凋亡信号通路的关系,为IRI中自噬与凋亡信号通路研究提供新的作用机制;揭示FIP-200对IRI引起的AKI具有预防和治疗双重作用,为AKI今后的防治提供新的思路和作用靶点。方法:1.利用Bilupus缺氧模块化系统建立体外人肾小管上皮细胞(HK2)缺氧复氧(H/R)的时间点模型,使用lipofectamine 3000将GFP-LC3质粒转染入HK2细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中GFP-LC3自噬斑点的形成情况以确定最佳的缺氧时间;2.过表达或敲减FIP-200在HK2细胞中的表达,采用定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)检测FIP200的表达以及采用Western blot检测自噬相关蛋白抗微管相关蛋白 1 轻链 3(anti-microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),beclin 1 及凋亡相关蛋白 caspase3、cleaved caspase3、Bcl-2 等的表达;使用lipofectamine 3000将GFP-RFP-LC3串联质粒分别与FIP-200过表达质粒或FIP-200 siRNA共同转染入HK2细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中GFP-RFP-LC3自噬流的情况。3.在野生型小鼠中,分别夹闭小鼠左侧肾动脉 15min、30min、45min、1h、2h、4h、6h 建立 IRI 模型;基于前期体内时间点模型的基础,针对野生型小鼠和肾小管上皮细胞条件性敲除FIP-200的基因敲除小鼠(FKO鼠)中,选用45 min的夹闭时间点建立IRI模型;实验分组:sham组、IRI组、FKO sham组、FKO IRI组;测定血清肌酐及尿素氮,利用常规病理染色(HE、PAS)观察肾小管损伤;通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测FIP-200、HMGB1 的表达与分布;Western blot 检测 FIP-200、LC3、beclin1、caspase3、cleaved caspase3、Bcl-2 和 HMGB1 蛋白的表达。4.利用 HMGB1的抗体进行免疫沉淀验证FIP-200与HMGB1的相互作用。结果:1.在细胞实验中随着缺氧时间的增加,细胞自噬增强,凋亡增加,在缺氧45min时,自噬和凋亡均显著增强。2.在动物IRI模型中随着缺血时间的增加,自噬增强,凋亡增加,肾小管出现损伤。在缺血45min时,肾小管出现明显的严重损伤,IHC显示出FIP-200的表达也显著增加。3.在体外H/R模型和体内IRI模型中,HMGB1和FIP-200的表达均显著增加。4.FKO小鼠与野生型小鼠相比,小管无明显差异,肌酐无明显增加,尿素氮有降低。在建立IRI模型以后,FKO小鼠在IRI以后肾小管上皮细胞损伤显著,血肌酐和尿素氮水平明显增高,Western blot结果提示其自噬有所减轻,TUNEL和Western blot结果均显示FKO小鼠在IRI后其肾小管细胞的凋亡明显增加。5.在HK2中,转染FIP-200过表达质粒,FIP-200表达较正常组明显升高,自噬增强,HMGB1表达明显增加;而在瞬时转染FIP-200 siRNA的细胞中,FIP-200表达较正常组明显减少,自噬降低,HMGB1表达降低。6.免疫沉淀显示FIP-200与HMGB1在肾小管上皮细胞中有相互作用。结论:1.在HK2细胞H/R模型中,敲减FIP-200,自噬减低,HMGB1表达也降低,凋亡却增加;而过表达FIP-200,自噬增强,HMGB1表达增加,细胞凋亡相对减少。2.FKO小鼠IRI后小管损伤明显加重,HMGB1表达显著降低。3.FIP-200与HMGB1在肾小管上皮细胞中有相互作用,可能是防治IRI所致AKI的潜在靶点。