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背景:最新统计数据显示:肺癌的发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤的首位,严重威胁人类的健康并且增加社会负担。而NSCLC的发病率约占肺癌总发生率的70%-80%,且约80%在最初发现时就已经是中晚期。因此,肺癌分子靶向治疗的研究成为热点,其中EGFR是治疗靶点之一。吉非替尼为代表的小分子靶向药物EGFR-TKI以其特异、高效、副作用小的特点,而被广泛的推广和临床应用。几个大型的III期临床试验的分析结果表明:NSCLC患者在应用EGFR-TKI药物后客观缓解率高达58%至83%之间,中位无进展生存期可延长至10-16个月。但是近来发现,许多EGFR-TKI治疗有效的患者在疗程至1-2年期间会出现病情迅速进展和恶化,即出现了EGFR-TKI的获得性耐药,使方兴未艾的分子肿瘤靶向药物治疗陷入瓶颈。因此,探讨EGFR-TKI耐药的分子机制找到延缓和逆转的靶点和途径是临床亟待解决的问题,更是分子肿瘤靶向治疗中急需攻关的重大的科学问题,也成为了目前肺癌分子靶向治疗研究的热点。RBM5是一种新的肿瘤抑制因子,主要分布于细胞核中,通过识别并结合m RNA调节相关基因的选择性剪切,来调控细胞周期和凋亡等过程,与肺癌的发生发展密切相关。我课题组前期研究发现,上调RBM5后可逆转人肺腺癌耐药细胞株对顺铂的耐药性,同时可下调Wnt/β-catenin信号通路。又因Wnt/β-catenin与细胞的增殖、分化和凋亡密切相关,并可以调控EGFR通路的传导。因此,我们推测:RBM5可能与EGFR-TKI获得性耐药相关,该基因表达水平的下调可能是获得性耐药的机制之一。故对RBM5的表达进行调控有望成为肺癌治疗和逆转耐药的新靶点。为验证此假说,我们分别通过体外和体内两个层面,以人肺腺癌细胞PC9及其耐吉非替尼细胞株PC9/AB2细胞为研究对象,以RBM5及Wnt/β-cantenin通路为靶点,通过增强RBM5基因的表达及联合应用Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂ICG-001,比较耐药细胞对吉非替尼敏感性的变化,同时比较Wnt/β-catenin通路和EGFR通路相关因子表达的变化,以明确RBM5、Wnt/β-catenin通路和EGFR通路之间相互调节的关系,以及EGFR-TKI获得性耐药的产生和逆转的可能机制。方法:1.人肺腺癌耐Gefitinib细胞PC9/AB2与其亲代细胞PC9的差异(1)CCK8方法比较人肺腺癌PC9细胞及其耐Gefitinib细胞株PC9/AB2细胞对Gefitinib的敏感性。(2)倒置显微镜观察比较PC9细胞和PC9/AB2细胞形态的差异。(3)RT-PCR方法检测PC9细胞及PC9/AB2细胞RBM5基因表达水平。(4)Western blot方法检测PC9细胞及PC9/AB2细胞中RBM5蛋白以及Wnt/β-catenin通路和EGFR通路相关蛋白的表达水平。2.过表达RBM5对PC9/AB2细胞EGFR-TKI获得性耐药的影响及其作用机制的研究(1)琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切pc DNA3.1-RBM5。(2)慢病毒感染效率的鉴定:(1)荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,判断感染效率;(2)RT-PCR方法检测带有RBM5基因的慢病毒载体的感染效率;(3)Western blot方法检测带有RBM5基因的慢病毒载体的感染效率。(3)CCK8法检测过表达RBM5的PC9/AB2细胞对Gefitinib敏感性。(4)Transwell法评估各处理组细胞的侵袭迁移能力。(5)细胞划痕实验评估各处理组细胞的迁移能力。(6)流式细胞术检测过表达RBM5对各处理组细胞周期和凋亡的影响。(7)RT-PCR方法检测Wnt/β-catenin通路及EGFR通路的相关基因的表达水平。(8)Western blot方法检测Wnt/β-catenin通路及EGFR通路的相关蛋白的表达水平。3.过表达RBM5对BALB/c裸鼠PC9/AB2细胞移植瘤生长的作用及机制研究(1)裸鼠称重并测量计算移植瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线。(2)RT-PCR方法检测各组裸鼠移植瘤中RBM5、β-catenin和EGFR基因表达水平。(3)裸鼠皮下移植瘤组织的免疫组化评估RBM5、β-catenin和p-EGFR蛋白表达情况。结果:1.PC9/AB2细胞与其Gefitinib敏感细胞株PC9细胞相比对Gefitinib的敏感性明显下降(P<0.001)。同时,倒置显微镜下观察发现,PC9/AB2细胞的体积增大,形态不规则。RT-PCR方法和Western blot方法检测结果发现,与PC9细胞相比,PC9/AB2细胞中RBM5基因和蛋白的表达量下降(P<0.01),且Wnt/β-catenin通路及EGFR通路相关蛋白的表达量升高(P<0.05)。2.琼脂糖凝胶电泳确定质粒带有目的基因RBM5,倒置显微镜、RT-PCR方法和Western blot方法证实带有RBM5基因的病毒载体成功感染PC9/AB2细胞,且RBM5基因稳定表达(P<0.001),建立高表达RBM5的体外细胞模型。3.过表达RBM5可以增加PC9/AB2细胞对Gefitinib的敏感性(P<0.001),同时可以抑制细胞侵袭和迁移能力,诱导细胞的G1期阻滞和促进细胞凋亡(P<0.05)。Wnt/β-catenin通路特异性阻滞剂ICG-001也可以增加PC9/AB2细胞对Gefitinib的敏感性,降低细胞侵袭、迁移能力,促进细胞凋亡。联合应用ICG-001后可以加强RBM5过表达引起的抑制细胞增殖、侵袭迁移能力和促进细胞凋亡的作用。4.过表达RBM5可以下调Wnt/β-catenin通路的相关因子β-catenin、c-Jun、c-Myc的基因和蛋白的表达,上调GSK-3β的基因和蛋白的表达,下调EGFR和AKT的磷酸化水平(P<0.05)。Wnt/β-catenin通路特异性阻滞剂可以下调EGFR相关因子(EGFR、Akt、Erk)的基因及蛋白表达水平(P<0.05)。5.成功建立过表达RBM5细胞裸鼠皮下移植瘤模型,且RBM5能在裸鼠移植瘤内稳定表达(P<0.01)。过表达RBM5能够抑制耐Gefitinib细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,下调Wnt/β-catenin通路和EGFR通路基因和蛋白的表达水平(P<0.05),且抑制Wnt/β-catenin通路后,EGFR的表达水平也下降(P<0.05)。同时,Wnt/β-catenin通路特异性阻滞剂ICG-001可以增加耐药细胞皮下移植瘤对Gefitinib的敏感性,抑制移植瘤的生长。联合应用ICG-001后可以加强RBM5过表达引起的肿瘤抑制作用。结论:1.RBM5与人肺腺癌EGFR-TKI获得性耐药相关,其表达的下调可能是获得性耐药的机制之一,上调RBM5的表达可以逆转耐药。2.RBM5可能为Wnt/β-catenin和EGFR交叉通路的关键调控因子,其可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导,抑制EGFR下游信号通路的激活,从而延缓或逆转EGFR-TKI获得性耐药。3.Wnt/β-catenin通路与EGFR-TKI获得性耐药相关,该通路抑制剂ICG-001可以增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性。过表达RBM5联合应用Wnt/β-catenin具有协同逆转EGFR-TKI获得性耐药的作用。综上所述,我们的研究证明了RBM5与EGFR-TKI获得性耐药密切相关,其可能是重要的耐药调控因子之一,调控RBM5的表达可能成为肺癌治疗和逆转耐药的新靶点,但其具体的调控机制还需要进一步深入研究。同时,我们为联合Wnt/β-catenin通路阻滞剂ICG-001与过表达RBM5治疗肺腺癌和逆转EGFR-TKI获得性耐药提供新思路和理论依据。