目的 本研究在人脑胶质瘤TIL细胞分离制备、TNF-α基因逆转录病毒载体转移系统构建的基础上，将TNF-α基因导入人脑胶质瘤TIL细胞中，放大TIL的体内外抗人脑胶质瘤效应。 方法 1．采用不连续密度梯度离心法从手术切除的胶质瘤组织中分离出TIL，并进行体外扩增和体外抗瘤活性测定。 2．在TNF-α逆转录病毒转移系统的建立及运载细胞TIL制备的基础上，利用构建的单克隆高滴度病毒细胞株PLC-2和PLJC-5将标记基因NeoR和目的基因TNF-α分别导入到TIL细胞中；对TNF-α基因转导后的TIL细胞进行细胞的增殖情况、TNF-α表达水平及对人脑胶质瘤TJ8510细胞的体外抗瘤活性的检测。 3．为了放大TIL的体内抗瘤效应，我们在利用TNF-α基因逆转录病毒转移系统将TNF-α基因转导至运载细胞-TIL中(TNF-TIL)，并对其体外增殖、抗瘤活性研究的基础上，对TNF-TIL在人脑胶质瘤裸鼠模型体内的抗瘤效应进行观察。 结果 1．成功地从10例经手术切除的胶质瘤组织中分离出TIL，人脑胶质瘤TIL经IL-2体外扩增30天，TIL从1.1×10~4-2×10~6扩增到1.1×10~7-1X 10＼平均扩增 274。45倍，表明人脑胶质瘤 TIL体外在 IL－二作用下可得到良好的增殖；人脑胶质瘤 TIL对 TJ85 10细胞杀伤活性与其培养时间相关刀L经 IL－二培养 10天，呈现出对肿瘤细胞的杀伤活性，但杀伤活性较低，而此时 LAK的杀伤活性明显高于 TIL；当培养20天时TIL杀伤活性迅速增加，而LAK杀伤活性迅速下降，两者差异显著；30天时TIL杀伤活性处于高峰，而LAK杀伤活性继续下降。提示人脑胶质瘤TIL对IL—2反应迟钝，活化潜伏期长，而LAK细胞则相反，TIL体外抗瘤活性与增殖能力相关。 工基因转导前后，细胞的增殖情况未受到明显影响，证明逆转录病毒中介的基因转移并不影响宿主细胞自身的功能皿L完全符合基因治疗中运载细胞的要求；对’INF－。基因转导后的TIL细胞TNF－a表达水平的检测结果显示：TNF－TIL细胞 TNF－。的分泌量远远超过 TIL细胞和 NeoR－TIL细胞；TNF－TIL细胞表达 TNF－二的动态观察结果：TNF－TIL细胞在体外培养30天，可持续表达高水平的TNF－a，说明导人TNF—a基因已完整、稳定地整合于TIL细胞基因组中并获得了表达。比较TIL、NeoR－TIL和 TNF－TIL三者的抗瘤活性，本实验结果表明：转导 TNF－a基因的TIL细胞对人脑胶质瘤TJ85 10细胞的体外抗瘤活性明显提高，与TIL和NeoR—TIL相比差异显著，我们认为这是由于 TNF—a基因转导TIL细胞后，能持续高水平地分泌内源性的TNF—a，从而放大了TIL自身的抗瘤活性。 3．局部转输TNF一TIL和静脉转输TNF－TIL均能明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长，且抑瘤效果高于TIL治疗组nL静脉转输无明显抑瘤效果，说明TNF－a基因转染TIL放大了TIL的体内抗瘤效应；而局部转输TNF－TIL较静脉转输TNF－TIL对肿瘤生长的抑制效果更为明显，提示过继性免疫治疗胶质瘤以局部转输方式为佳。虽然静脉转输TNF—TIL的治疗效果不及局部转输，但也能抑制人脑胶质瘤裸鼠皮下实体瘤的生长，与单纯静脉转输TIL的抑瘤效果差异显著。我们认为其原因可能是：①TNF－a基因转染后，放大了肿瘤局部TIL的抗瘤效应；②．血循环中的TNF－TIL分泌的TNF－a可能在一定程度上发挥了全身抗肿瘤作用。 ·2· 结 论 l．人脑胶质瘤TIL具有良好的体外增殖能力，逆转录病毒中介TNF－a基因导人人脑胶质瘤TIL后，其体外增殖能力末受明显影响，符合人脑胶质瘤淋巴因子基因治疗运载细胞的要求。 2．逆转录病毒中介TNF－a基因导人人脑胶质瘤TIL后，能持续＼稳定地表达TNF－a，其体外抗瘤活性高于TIL，两者差异显著。 3．逆转录病毒中介TNF－a基因导人人脑胶质瘤TIL后，放大了TIL体内抗肿瘤效应，肿瘤局部转输和l静脉转输TNF－TIL对人脑胶质瘤裸鼠皮下实体瘤的均有明显的抗瘤效应，以局部转输方式为佳。