研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在我国占全身各种恶性肿瘤的7%-8%,仅次于子宫颈癌,近年来有超过子宫颈癌的倾向,并呈逐年上升趋势,部分大城市报告乳腺癌占女性恶性肿瘤之首位。自19世纪末开始,乳腺癌(改良)根治术在控制疾病进展、改善患者生存率方面起了不可替代的作用,但其术后并发症多也是人们不可忽视的问题。随着医疗设备、技术及方法的不断改进,保乳术逐步开展。保乳术与根治术相比,具有保全患者的生理功能、美容和并发症少等优点,大大提高了患者的生活质量,明显改善了患者因切除器官导致的心理障碍问题。但其局部复发率高,术后将根据条件予以放疗,从而有效杀灭残留微小病灶、减少疾病复发。全乳放疗再追加瘤床的放疗剂量是降低疾病复发的关键,可显著提高肿瘤局控率,但可能引起心、肺损伤及上肢水肿等并发症。如何在提高放疗效果的同时减少对正常人体组织的影响成为人们研究乳腺癌辅助治疗的一项重要课题。近十年来,人们在肿瘤分子靶向治疗方面的研究取得了很大的进展,为改善肿瘤患者的预后提供了理论基础。通过干预肿瘤细胞中存在的分子靶点,可在提高局部放射效果的同时,降低副反应的发生,为乳腺癌患者提高生活质量带来裨益。DNA聚合酶θ(POLQ)是1990年发现的人类第八位DNA聚合酶,是DNA聚合酶A家族成员之一,具有DNA双链断裂(DSB)和DNA链间交联(interstrand cross link, ICL)修复的重要特性。它参与了DNA损伤耐受,与保持基因完整性密切相关。缺乏该酶的小鼠网织红细胞可出现异常核分裂或染色体断裂的增加。部分正常组织细胞或肿瘤细胞内缺少该酶时,将导致细胞对过氧化氢、γ射线、争光霉系等外界因素反应敏感,原因是POLQ缺失或突变的细胞染色体稳定性差,进而损伤或抑制DNA的复制和转录,从而导致肿瘤、共济失调性毛细血管扩张症和奈梅亨染色体不稳定综合征等疾病的发生。利用该酶的这一特点,Higgins等通过外源基因,干预POLQ在宫颈癌Hela、喉癌SQ20B和胰腺癌PSN1等细胞株中的表达,证实了沉默POLQ与增加细胞的放射敏感性有着直接的联系。增加肿瘤细胞对放射线的敏感性,可以通过较小放射剂量达到同等的放疗效果,从而降低了对正常组织的损伤,以及放射线本身可能带来的二次诱癌几率。之后该课题组运用回顾性分析方法,发现大量早期乳腺癌患者切除的肿瘤组织中POLQ过表达,并证实与患者不良临床预后、雌激素受体阴性和肿瘤病理学分级差密切相关,而后两者经临床研究证实,均可作为独立因素导致患者预后不良。干预POLQ的表达将可能抑制肿瘤细胞的增殖,降低复发和转移风险；避免肿瘤细胞或组织对辅助治疗产生耐受,改善患者预后。Lemee通过对13个核酸DNA聚合酶基因的研究发现,在乳腺癌中高表达而在正常乳腺组织中非高表达的惟一基因是POLQ。这提示干预POLQ在人体的表达,在可能提高乳腺肿瘤细胞放疗敏感性的同时,对正常乳腺组织几乎不产生影响。乳腺癌细胞对放射线杀伤具有中等敏感度,肿块局部切除后会给予较高剂量放射治疗。在放射线杀死乳腺肿瘤细胞的同时,周围正常组织亦遭受一定的损伤。所以,提高癌细胞对放疗的敏感性,将可使疗效大大提高。我们拟用蛋白印迹法(Western blot)明确POLQ在人类乳腺癌细胞株MCF-7中的表达后,利用RNAi技术,将设计合理的siRNA转染入人类乳腺癌细胞株MCF-7中,使得POLQ被有效沉默。之后,用不同剂量X射线照射转染前后的MCF-7细胞,观察POLQ沉默对该细胞株放疗敏感性的影响,并进一步探讨POLQ沉默后MCF-7乳腺癌细胞株放疗敏感性变化的可能机制。目的：利用RNAi沉默人类乳腺癌细胞株MCF-7中POLQ蛋白的表达,之后通过体外实验观察转染后MCF-7细胞增殖能力和凋亡率的变化,以及POLQ沉默对该细胞株放射敏感性的影响,为提高乳腺癌细胞对放疗的敏感性提供一条新思路。方法：1.利用蛋白印迹法检测人类乳腺癌细胞株MCF-7中POLQ蛋白的表达水平；根据POLQ基因编码区序列,设计并合成小干扰RNA序列(POLQ-siRNA),经脂质体LipofectamineTM2000介导转染入乳腺癌细胞株MCF-7中；2.荧光显微镜下观察siRNA对MCF-7细胞株的转染效率：取贴壁良好的MCF-7细胞铺于24孔板,待细胞生长密度达到60～70%时,用终浓度5、10、20、40、80nmol/L的Control-siRNA-FAM和1.5、2、2.5、3μl/ml的脂质体LipofectamineTM2000交叉配制成siRNA-脂质体复合物,20min后加入孔内,6～12h在荧光显微镜下观察转染效率；3.MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别从基因和蛋白水平检测POLQ表达率的变化,明确POLQ-siRNA转染对mRNA和蛋白的抑制效率4.利用平板克隆形成实验检测转染前后MCF-7细胞克隆形成能力的变化：各组细胞于转染6h后用胰蛋白酶消化,细胞精确计数,100个/孔接种于六孔板中,每组设三个平行对照。之后放于5%CO2培养箱中继续孵育2周。当每孔内出现肉眼可见的克隆时,终止培养,弃去培养液。用4%多聚甲醛固定20min,0.1%结晶紫染色15min。计数>50个细胞的克隆,计算克隆形成率(PE)；5.噻畔蓝(MTT)比色法检测转染前后MCF-7细胞增殖能力的变化：MCF-7细胞按4.5×103个/孔铺于96孔板中,孵育24h后接受转染。分别于转染24、48和72h后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,继续孵育4h后弃去上清液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)溶液150μl,摇床上振荡10min,在酶标仪上读取490nm波长的吸光度(A)值；6.平板克隆形成实验检测转染前后MCF-7细胞对放射的敏感性：MCF-7细胞按不同浓度接种于六孔板中,孵育24h后接受不同剂量X线照射,根据平板克隆形成实验结果运用单击多靶模型拟合细胞存活曲线,用放射增敏比(SER)作为放射敏感性的量化指标,观察细胞对放射的敏感性；7.流式细胞术检测不同放射剂量下细胞周期和凋亡率的改变,探讨POLQ沉默导致放疗增敏的可能机制。8.统计学分析：采用GraphPad Prism4Demo软件按单击多靶模型拟合存活曲线。应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,qRT-PCR检测结果CT值采用均值(x)表示,其余计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示,每组实验数据经统计符合正态性分布,结果显示方差整齐,3组细胞的蛋白含量[平均吸光度(INT)x杂交信号面积(S)]和平板克隆形成率之间的的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用LSD法,吸光度A值、3组细胞各个细胞周期不同照射剂量点间比较和每组不同照射剂量点间细胞凋亡率的比较采用单因素重复测量数据的方差分析方法,检验水准α=0.05。结果：1.以宫颈癌Hela细胞株为阳性对照,Western blot实验证实细胞株MCF-7中POLQ蛋白高表达。该蛋白在体外容易被降解为～170kDa和～100kDa的片段；2.荧光显微镜下显示,终浓度分别为siRNA40nmol/L和脂质体2.5μl/ml时,POLQ-siRNA能有效转染入MCF-7细胞中,细胞计数法显示其转染效率在90%以上；3. qRT-PCR和Western blot实验表明,siRNA转染入MCF-7细胞后POLQ-siRNA组细胞POLQ mRNA和POLQ蛋白表达量分别是空白对照组的12.158%和(32.013±0.654)%。4.转染前后MCF-7细胞增殖能力的变化：平板克隆形成实验结果显示siRNA转染入MCF-7细胞后细胞克隆形成率降低；MTT法检测结果显示,实验组细胞增殖能力低于空白对照组(P=0.000),阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学意义(P=0.167)；5.根据平板克隆形成实验结果计算出不同X线照射剂量下的细胞存活分数,对存活分数按照单击多靶模型进行拟合。放射生物学参数显示,POLQ沉默组MCF-7细胞后D0、Dq值显著降低,放射增敏比(SER)等于1.24,提示转染POLQ-siRNA后MCF-7细胞对放射的敏感性显著增强。6.细胞周期结果显示,未照射时POLQ-siRNA组S期细胞比例低于空白对照组(P=0.001)；Control-siRNA组与空白对照组比较差异无统计学意义(P=0.952)。0、4和8Gy时POLQ-siRNA组Go/G1期细胞均高于空白对照组,Control-siRNA组与空白对照组之间差异无统计学意义。随着照射剂量的增加,POLQ-siRNA组、Control-siRNA与空白对照组细胞G2/M期比例均提高(P<0.01)。在不同照射剂量下,POLQ-siRNA组细胞凋亡率均高于空白对照组,Control-siRNA组与空白对照组比较差异无统计学意义。当照射剂量由4Gy增大至8Gy时,3组细胞凋亡率均减小(P<0.01)。结论：POLQ在人类乳腺癌细胞株MCF-7中高表达,siRNA可以有效沉默POLQ在MCF-7中的表达；POLQ沉默可以减弱MCF-7细胞的增殖能力,提高该细胞G0/G1期比例和凋亡率,显著提高对放射的敏感性；持续增加X线照射剂量将导致MCF-7细胞G2/M期比例增加,而不能导致凋亡率持续增加。