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目的应用RNA干扰技术抑制人survivin基因的表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin编码框采用生物信息学,设计2组siRNA相关基因片段和1组阴性对照siRNA片段,序列经BLAST查询,确定为survivin特异性序列,排除与其他基因同源,把所得序列交Sigma生物公司体外合成。应用脂质体转染法将基因转染入乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测各组细胞在不同时间段的细胞增殖率、RT-PCR和western blot法观察阻断survivin表达后对乳腺癌细胞survivin mRNA和蛋白质表达的抑制率、Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞(FCM)检测各组细胞凋亡率。统计学数据处理用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS17统计软件处理数据,多组均数间的比较采用单因素方差分析,然后用SNK进行两两比较,两样本均数的比较采用独立样本的t检验,P<0.05表示有显著性差异。结果取对数生长期的SKBr-3细胞铺板,siRNA通过脂质体转染SKBr-3细胞,在倒置显微镜下观察见：细胞出现明显的细胞皱缩、形态变圆、核分裂相减少、漂浮细胞增多等凋亡改变;MTT法显示2组siRNA对SKBr-3细胞增殖有抑制作用,抑制率明显高于空白对照组及阴性对照组(p<0.01),且抑制作用具有时间依赖性,其作用最佳时间为转染后48h,其细胞抑制率为(43.1±0.3)%；RT-PCR试验显示2组siRNA组作用于SKBr-3细胞48h后survivin mRNA表达明显下调(p<0.01),survivin mRNA表达的条带亮度低于其余各组,其mRNA相对表达量分别为：0.203±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%。而空白对照组和阴性对照组survivin mRNA水平无明显变化；western blot实验见2组siRNA转染组survivin蛋白表达显著下调(p<0.01),蛋白条带的灰度低于其余各组,其蛋白相对表达量分别为：0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%；于转染48h后收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示2组siRNA转染组细胞凋亡率分别为(14.2±1.4)%、(16.8±0.6)%,明显高于其他2组,统计学分析差异有显著性(p<0.01),而该两组间细胞的增殖与凋亡无明显差别。结论1、本实验针对survivin构建的2组siRNA,确实能有效封闭survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡。一方面提示survivin与乳腺癌的发生、发展、治疗及预后有密切的关系；另一方面提示RNA干扰可用于特异性阻断survivin表达,为靶向诱导乳腺癌细胞凋亡治疗提供了实验依据,为乳腺癌的基因治疗提供了理论基础。2、与survivin mRNA无同源性的阴性对照则对SKBr-3乳腺癌细胞的增殖和凋亡无明显影响,体现了RNAi的特异性优点。3、下调survivin基因的表达来抑制细胞增殖,是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。4、下调survivin基因的表达,可明显改善肿瘤细胞的异常生物学行为。5、RNAi技术具有高效率、高特异性和显效快等优点,可以作为肿瘤基因治疗的理想技术方法。