早期断奶引起的仔猪早期断奶应激综合症是养猪生产中的大事件，给养猪业带来了巨大的经济损失。早期断奶给仔猪造成的最明显损伤就是导致仔猪肠道屏障功能损伤。有研究证实,细胞凋亡紊乱会导致肠黏膜屏障功能障碍和胃肠功能损伤，而自由基代谢异常与凋亡紊乱密切相关。本课题组前期研究也发现，早期断奶会导致仔猪血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是断奶导致的仔猪自由基代谢异常与肠细胞凋亡及肠屏障功能之间的关系仍未可知。 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC），作为一种强有效的抗氧化剂，已广泛应用于临床疾病治疗研究，但对于其能否调控断奶应激仔猪的自由基代谢和肠道细胞凋亡过程，减少肠道屏障损伤，缓解断奶应激综合症及其机理还未见报道，为此，本文开展以下四个研究1早期断奶过程中仔猪肠道细胞凋亡研究以酶学ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端标记、透射电镜法观察肠组织形态变化，并对凋亡相关基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）进行qRT-PCR表达分析，研究21日龄断奶仔猪肠道细胞的凋亡过程，探讨断奶仔猪肠细胞凋亡的分子机理。结果显示，早期断奶会导致仔猪肠道组织DNA呈片段化，断奶后仔猪血清凋亡酶Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的含量显著高于(P <0.05)对照哺乳组。形态学观察显示，断奶后仔猪肠细胞凋亡显著增加，肠细胞凋亡指数极显著高于对照哺乳组(P <0.01)，凋亡染色主要着色于肠绒毛顶端舌尖位置，而对照组仔猪肠绒毛着色较少。断奶后，仔猪某些肠细胞表现为明显的坏死特征：细胞膜破裂、相邻细胞间的紧密连接丧失、线粒体破坏。另有一些肠细胞表现为明显凋亡特性：微绒毛脱落、稀疏排列，线粒体边缘化，细胞膜皱缩。而对照哺乳组仔猪小肠黏膜表面微绒毛排列较紧密，细胞连接较紧密。定量结果显示，断奶后仔猪肠道中促凋亡基因Bax和Caspase-9表达无显著性差异（P>0.05），而抑凋亡基因Bcl-2表达下调，死亡受体基因Fas（P <0.01）和促凋亡基因Caspase-3和Caspase-8基因（P <0.05）表达显著上调。结果表明，断奶会导致仔猪肠组织DNA片段化，凋亡酶活性增加，促进肠细胞凋亡，且凋亡与坏死同时存在，凋亡的内源性和外源性途径都被激活。2早期断奶仔猪自由基代谢与肠细胞凋亡及肠道屏障功能关系研究分别测定21日龄断奶仔猪血清和肠道中CAT、SOD、GSH-Px、MDA活性。利用ELISA检测血清皮质醇、HIF-1α、TNF-α水平，通过研究断奶过程中仔猪抗氧化能力、肠道的通透性和小肠粘膜中整合素αvβ6和跨膜蛋白Occludin蛋白和连接蛋白ZO-1的mRNA表达，探讨断奶仔猪的肠道屏障的功能。采用多元分析法建立自由基与断奶仔猪肠细胞凋亡和肠道屏障功能的关联分析，探讨断奶仔猪自由基代谢与细胞凋亡和肠道屏障功能的关系。结果显示：断奶后仔猪血清中皮质醇、HIF-1α和TNF-α含量显著高于(P <0.05)对照哺乳组，断奶后仔猪血清SOD和GSH-Px酶活力显著降低（P <0.05）。断奶后，脂质过氧化产物MDA含量显著增加（P <0.05），而血清抑制羟自由基的能力显著下降（P <0.05）。断奶后血清NO和H2O2的含量与对照哺乳组无显著性差异（P>0.05）。qRT-PCR结果显示，断奶后仔猪肠道中整合素αvβ6（P>0.01）表达显著上调，而紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin-1表达极显著下调（P <0.05）。结果表明，断奶会导致仔猪血清抗氧化能力降低以及紧密连接表达下降，导致肠屏障功能障碍。断奶导致的仔猪肠细胞凋亡增加与整合素αvβ6的表达密切联系，且凋亡的增加与抗氧化能力的降低和自由基代谢增加显著相关。3断奶仔猪小肠基因表达谱及细胞凋亡代谢网络分析采用全基因组表达谱芯片技术分析早期断奶仔猪肠道差异表达基因，探索早期断奶仔猪肠道代谢途径变化与断奶应激间的关系，重点分析肠细胞凋亡相关基因表达的差异，获取与仔猪断奶应激密切相关的目标基因，应用生物信息学技术分析差异表达基因的功能及其与断奶仔猪肠道细胞凋亡的关系，并以qRT-PCR技术研究相关目标基因的表达量，绘制肠道细胞凋亡信号通路图，从基因水平上阐明断奶应激仔猪肠道细胞凋亡的机制。通过猪的全基因组芯片，筛选出了445个差异表达基因，其中159个表达下调，286个表达上调。与细胞活动过程相关的上调基因51个，下调基因25个，这些基因主要参与细胞分化、细胞移位、细胞死亡、细胞周期等。KEGG分析显示，下调基因主要富集于免疫应答调控途径，而上调基因主要富集于细胞凋亡途径、信号转导途径以及内分泌调控途径。定量结果显示，与凋亡相关基因（CYCS、BAD和ATM），促炎因子（IL-8和TNF）以及转录因子（NFATC2和NOS2）表达上调，细胞周期调控相关基因E2F5和Smad4以及信号转导因子C-JUN表达下调。结果表明，断奶后，仔猪肠细胞调控过程最为活跃。断奶会导致细胞周期停滞，加速细胞凋亡，抑制细胞增殖，解析了断奶应激综合症的机制，为开发缓解断奶应激综合症的新方法提供理论依据。4NAC对断奶仔猪肠屏障功能的调控及作用机理通过在21日龄断奶仔猪日粮中添加NAC，初步研究NAC对早期断奶仔猪抗氧化能力及肠道细胞凋亡的影响，选择细胞凋亡及细胞周期调控相关基因进行mRNA表达分析，探讨NAC对断奶仔猪肠道细胞凋亡和肠道屏障损伤修复作用的分子机理。结果发现，NAC可有效降低断奶仔猪血清中皮质醇含量(P <0.05)，降低HIF-1α的水平(P <0.05)，但对TNF-α的含量无显著影响(P>0.05)。日粮中添加NAC可显著提高血清SOD和GSH-Px以及肝脏中SOD活性(P <0.05)。但是添加NAC对断奶仔猪血清和肝脏MDA含量以及肝脏中GSH-Px的活性均无显著影响(P>0.05)。断奶后仔猪肠道绒毛宽度和高度显著降低(P <0.05)，隐窝增生(P <0.05)。NAC处理后，仔猪绒毛宽度和高度显著增加(P <0.05),绒毛结构相对完整。NAC日粮处理可有效降低细胞凋亡指数（P <0.05），减少肠细胞凋亡。透射电镜结果显示，NAC处理后，肠细胞形态完整，小肠黏膜表面微绒毛排列紧密。相较于断奶组，NAC处理后，凋亡相关基因死亡受体Fas表达显著下调（P<0.05），抑制凋亡基因Bcl-2显著上调（P <0.05），Caspase-8、9表达虽有下降但无显著性差异(P=0.141, P=0.206）。仔猪肠细胞周期调控基因E2F5、Smad4表达显著上调（P <0.05），凋亡启动子基因ATM表达呈上调趋势，创伤愈合指示基因整合素αvβ6表达显著下调（P <0.05）。表明NAC在一定程度上可以缓减仔猪断奶应激，提高仔猪抗氧化能力，抑制肠细胞死亡，保护肠细胞结构的完整性。NAC对断奶仔猪肠细胞的保护不仅仅是简单的调控细胞凋亡途径，还涉及到细胞周期调控。综上所述，早期断奶造成的氧化应激会导致仔猪抗氧化能力降低、自由基代谢异常，进而激活肠细胞凋亡的内源性和外源性途径，加速肠细胞凋亡，引起肠屏障功能障碍。断奶后肠细胞凋亡和坏死现象同时存在。断奶仔猪肠细胞凋亡的增加与仔猪抗氧化能力降低和自由基代谢显著相关。基因表达谱分析显示，断奶后仔猪肠细胞调控过程活跃，细胞周期调控过程遭到抑制。NAC在一定程度上可以缓减肠道应激损伤，抑制细胞死亡，保护肠细胞的完整性，其对肠细胞的保护不仅仅是简单调控细胞凋亡途径，还涉及对细胞周期的调控，但NAC的具体调控作用还需进一步研究。