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第一部分B细胞通过TLR9-TIMP1信号通路参与调控1型糖尿病发生发展的机制研究研究背景1 型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病,是影响青少年儿童健康的主要疾病之一。根据我国T1D流行病学证据显示,我国T1D发病率较前明显增加。进行性胰岛功能的损失导致T1D患者需终身使用胰岛素治疗,鉴于其逐年增高的发病率和复杂难治的并发症,T1D已成为重大的公共卫生挑战。在T1D发病环节中,由T细胞介导的胰岛局部免疫应答起到重要作用,可导致功能性胰岛β细胞群的缺失和血糖升高。因此,有效阻止和(或)逆转β细胞功能进行性下降是治疗T1D的重要策略。传统的胰岛素和口服降糖药治疗方案只能对症处理高血糖,并不能阻止胰岛β细胞功能的进行性衰竭及糖尿病并发症的发生及发展。越来越多的研究显示,特异的靶向分子治疗可以有效的维持及修复受损的胰岛β细胞功能,并延缓糖尿病并发症的发生发展。Toll样受体9(TLR9)主要参与机体先天性免疫与适应性免疫应答反应,本课题组前期研究证实,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠TLR9的缺失可以降低T1D发病率,参与调控胰岛β细胞的局部免疫应答反应。目前关于B细胞TLR9分子调控胰岛β细胞的功能性机制尚未完全清楚,本研究基于前期研究基础,深入探讨B细胞内TLR9在T1D发病过程中的作用及分子机制。研究目的通过特异性敲除B细胞内TLR9分子的小鼠模型,探究B细胞缺失TLR9,对于T1D发生发展的影响及作用机制。研究方法1.构建特异性敲除B细胞TLR9模型小鼠,监测糖尿病发病率构建实验组TLR9fl/fl CD 19cre+NOD小鼠模型、同窝的对照组TLR9fl/fl CD19cre-NOD小鼠模型,从10周龄至32周龄,每周定期监测小鼠血糖,绘制糖尿病发病率趋势图。2.多色流式细胞学方案设计(表面及细胞因子水平)采用流式细胞术多染色法标记外周免疫组织B淋巴细胞的表面分子,包括CD19、B220、CD40、TCR-β、CD5、CD1d、CD21、CD23 分子,根据表面标志圈出各亚群比例和数目。3.过继性细胞输入至Rag-/-NOD小鼠体内纯化分离的B细胞联合T1D小鼠的T细胞共同静脉回输至Rag-/-NOD小鼠体内,每周监测B细胞对Rag-/-NOD小鼠T1D发病率的影响。4.体外B细胞微阵列芯片技术分离纯化的B细胞采用全基因组微阵列芯片技术检测TLR9在mRNA水平上对B细胞的影响。研究结果1.缺失TLR9的B细胞显著降低NOD小鼠T1D发病率。结果表明B细胞特异性敲除TLR9后可以显著延缓T1D的发病时间,对于T1D具有显著保护作用。2.TLR9参与调控B细胞亚群的比例和功能。B细胞特异性敲除TLR9分子后,NOD小鼠胰腺引流淋巴结内分泌IL-10的CD1d+CD5+调节性B淋巴细胞(Bregs)亚群比例水平显著上调,边缘区B淋巴细胞比例显著增加,过渡性B淋巴细胞比例显著降低。3.特异性敲除TLR9的B细胞对先天性免疫刺激、适应性免疫刺激的反应均减弱。4.特异性敲除TLR9的B细胞可以上调IL-10分泌并直接影响T细胞增殖活力。5.TLR9通过下调组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP 1)影响IL-10+B细胞的功能,下调IL-10表达,从而促进T1D的进展。研究结论1.B细胞的TLR9分子在调控T1D的发生发展中起关键性作用。2.B细胞内TLR9主要通过调控Bregs细胞亚群比例及功能发挥抑制T细胞增殖的能力。3.B细胞内TLR9可以直接影响T1D的发病率。4.B细胞内TLR9通过MMP19/TIMP 1/CD40信号通路下调IL-10分泌及表达,介导T1D的发生发展。第二部分胰岛β细胞TLR9分子介导肠道菌群调控肥胖的机制研究研究背景肥胖是一种危害全人类健康的代谢性疾病,由多种因素介导,以系统性、慢性、低度炎症为重要特征。慢性低度炎症已被证实是肥胖及相关代谢性并发症发病的核心环节。肠道菌群失调、肠道屏障破坏会导致微生物群或其产生的内毒素进入循环系统引起机体低度炎症。TLR9可以识别微生物、激活机体产生免疫细胞应答。存在于胰岛β细胞内的TLR9,参与胰岛内的免疫细胞浸润,TLR9通过介导免疫应答,引发炎症因子的瀑布反应,导致出现全身炎症反应综合征。由此提示,TLR9与肠道微生物共同参与肥胖的低度炎症状态的发生发展。研究目的通过特异性敲除胰岛β细胞内TLR9分子的小鼠模型,探究β细胞缺失TLR9识别,对于肥胖发生发展的影响,为TLR9治疗肥胖提供新的研究思路。研究方法1.构建特异性敲除胰岛β细胞TLR9模型小鼠,监测体重变化,行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)与胰岛素耐量实验(ITT)通过TLR9-/-C57BL/6小鼠与Pdx1cre+C57BL/6小鼠杂交,培育TLR9fl/fl Pdx1cre+C57BL/6小鼠模型作为实验组;Pdx1cre+C57BL/6小鼠作为对照组。给予60%高脂饲料喂养,每周定期监测小鼠体重,绘制体重趋势图,从6周龄监测至高脂12周,行IPGTT与ITT。2.多色流式细胞学方案设计采用流式细胞术多染色法标记B细胞、T细胞、巨噬细胞等淋巴细胞、胰岛β细胞、胰岛α细胞表面分子,包括CD19、B220、CD40、TCR-β、CD5、CD1d、CD21、CD23、CD11c、CD11b、IAb、IgA、Gr1、Flouzin、CD45 等,圈出各细胞亚群比例和数目。3.粪便移植至无菌C57BL/6(GFB6)小鼠体内无菌条件下,取新鲜大便并重悬至特定浓度,给予GFB6小鼠灌胃处理。菌群移植成功与否,通过检测GFB6小鼠肠道菌群验证。4.肠道菌群16sRNA检测菌群成分及多样性分析16sRNA测定肠道菌群基因序列。通过运算分类单位(OTUs)聚类分析、OTU丰度表计算不同样品间的物种组成结构差异,通过主坐标分析(PCoA)研究肠道菌群组成成分的β多样性。5.酶联免疫吸附法(ELISA)检测免疫因子水平、聚合酶链式反应(PCR)检测基因表达酶联免疫吸附法检测小鼠外周血清、肠道冲洗物免疫球蛋白水平,PCR检测抗菌肽、胰岛分化等相关基因的表达。研究结果1.β细胞特异性缺陷TLR9能够预防肥胖的发生发展。研究发现TLR9fl/fl Pdx1cre+和Pdx1cre+C57BL/6小鼠在高脂诱导肥胖后,实验组小鼠IPGTT显示葡萄糖反应性增强,ITT显示胰岛素敏感性增强,体重显著低于对照组肥胖小鼠;实验组小鼠附睾周围脂肪含量增加、肝脏质量显著下降。2.β细胞内TLR9调节B细胞亚群、T细胞亚群及巨噬细胞亚群比例和功能。在外周免疫组织、器官中,实验组小鼠显示出下调的活化T细胞亚群比例,显著上调的Bregs细胞亚群比例,显著下调的巨噬细胞亚群比例,伴随着外周血清细胞因子IL-10及IgM水平显著上调。3.β细胞内TLR9参与调控小肠抗菌肽表达。研究发现实验组小鼠小肠抗菌肽基因表达改变,主要表现为Reg3gmma、RelmB mRNA表达显著上调,抗菌肽整体表达呈现上升趋势。4.β细胞内TLR9与肠道菌群共同参与调控胰岛数目、功能。实验组小鼠的胰岛高表达Insulinl、Glucagon基因,并伴随胰岛抗菌肽表达的上调。5.β细胞内TLR9直接参与调控肠道菌群,介导免疫应答反应。通过粪便移植,实验组受体小鼠出现与实验组小鼠类似的IPGTT和ITT结果,实验组受体小鼠显示出显著上调的抗炎性Treg细胞、Breg细胞亚群比例和下调的促炎性巨噬细胞比例。6.β细胞内TLR9对肠道菌群组成成分和多样性的影响。与对照组相比,实验组粪便移植至GF B6小鼠后,实验组GF B6小鼠的肠道通透性显著降低,两组菌群β多样性差异显著,总体引发肠道菌群中益生菌群比例上调。7.β细胞缺失TLR9后,通过调节肠道菌群-免疫应答,参与调控胰岛β细胞数目、功能。粪便移植后实验组受体小鼠胰岛数目和β细胞比例显著增多,实验组供体与受体小鼠血清、肠道冲洗物中IgA表达显著上调。研究结论1.β细胞内特异性缺陷TLR9能够预防肥胖的发生发展,这与B细胞亚群、T细胞亚群及巨噬细胞亚群参与的免疫细胞应答有关;2.β细胞内TLR9参与调控小肠内抗菌肽表达,调控TLR9-肠道菌群并下调胰岛数目、功能;3.β细胞内TLR9可显著改变肠道菌群组成成分、多样性,改变的肠道菌群参与介导免疫应答反应;4.β细胞内TLR9通过介导肠道菌群-免疫应答,共同参与调控胰岛β细胞数目、功能,影响肥胖的发生发展。