第一部分肿瘤标志物Hsp90α在胶质瘤生长和转移中的作用[目的]胶质瘤是常见的一种恶性肿瘤病,Hsp90α在胶质瘤的生长和转移中有重要影响。本实验旨在检测Hsp90α对胶质瘤的发生、发展的作用。[方法]利用免疫印迹法的方法检测三株胶质瘤细胞SHG44、C6及U251内Hsp90α的含量。用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化透析Hsp90α,制备抗Hsp90α的兔多抗和小鼠单抗。通过体外细胞侵袭实验检测Hsp90α抗体对胶质瘤细胞侵袭的抑制作用及Hsp90α对胶质瘤细胞侵袭促进作用。构建MMP-2的过量表达和其shRNA的载体,并构建Hsp90α野生型和T90A突变体的过量表达载体,通过细胞侵袭实验来检测MMP-2对Hsp90α促进细胞侵袭的协同作用。通过建立裸鼠胶质瘤模型及免疫荧光染色检测Hsp90α的抗体对胶质瘤的转移的影响。[结果]1-分泌型Hsp90α的含量随胶质瘤细胞的恶性程度而增加用免疫印迹法检测细胞内Hsp90α的含量,实验结果示,在三株胶质瘤细胞系中Hsp90α的含量基本相同,而分泌型Hsp90α的含量随胶质瘤细胞的恶性程度的增加而增加。2.Hsp90α促进胶质瘤细胞的侵袭我们用抗Hsp90α的兔多抗和小鼠单抗进行体外细胞侵袭实验,两组对比,抗Hsp90α抗体组对胶质瘤细胞侵袭的抑制力明显大于对照组,提示Hsp90α且有促进胶质瘤细胞侵袭的作用。3. Hsp90α促进胶质瘤细胞的侵袭作用依赖于MMP-2通过细胞侵袭实验,结果示Hsp90αWT对胶质瘤细胞侵袭的促进能力明显强于Hsp90αT90A。当细胞同时转染MMP-2时,Hsp90αWT对胶质瘤细胞侵袭的促进作用会进一步增强。[结论]Hsp90α的含量随胶质瘤细胞的恶性程度的增加而增加。Hsp90α具有促进胶质瘤细胞侵袭的作用。MMP-2对胶质瘤细胞的侵袭有协同作用。第二部分肿瘤标志物Hsp90α与胶质瘤恶性程度的相关性[目的]研究已知Hsp90α的含量与胶质瘤细胞的恶性程度有关,且Hsp90α能促进胶质瘤细胞的侵袭。本实验部分主要验证Hsp90α是肿瘤特异性标志物,且与肿瘤恶性程度有相关性。[方法]通过裸鼠皮下种植胶质瘤细胞建立动物模型,收集裸鼠血清,用Hsp90α兔多抗、Hsp90α大鼠单抗进行免疫沉淀,用免疫印迹法检测裸鼠血清中Hsp90α。收集人血清,用同样的方法检测人血清中Hsp90α。用ELISA法来检测人血清中Hsp90α的浓度、与胶质瘤转移的相关性及与炎症的相关性。建立裸鼠种植瘤模型,通过免疫反应验证Hsp90α是由胶质瘤细胞分泌而来的。[结果]1. Hsp90α的含量与胶质瘤恶性程度有一定相关性用免疫印迹法检测裸鼠及人血浆Hsp90α。结果示,胶质瘤小鼠的免疫沉淀的产物中可以检测到Hsp90α,而在正常小鼠中却检测不到；胶质瘤病人血浆Hsp90α明显高于正常人。ELISA法来检测人血清中Hsp90α的浓度,恶性胶质瘤患者血浆中Hsp90α的含量明显高于正常人和良性胶质瘤患者(P<0.05)。2. Hsp90α的水平与胶质瘤转移有相关性收集胶质瘤病人及正常人的血清,ELISA法来检测血清中Hsp90α的浓度,结果示发生转移的患者的血浆Hsp90α的水平明显高于较未发生转移的病人(P=0.003)。3.人血浆样品中Hsp90α的水平与炎症无相关性收集肺炎、肝炎病人的血浆,ELISA法检测其Hsp90α的浓度,结果显示,肺炎和肝炎患者与正常人(3例)相比,血浆中Hsp90α的浓度没有明显差异(P值分别为0.2988、0.5177、0.138)。4.血浆中的Hsp90α是由胶质瘤细胞分泌而来的建立裸鼠人源胶质瘤细胞种植瘤模型,用人源Hsp90α特异性抗体进行免疫反应,结果示,种植人源胶质瘤的小鼠血浆中的Hsp90α可以被人源Hsp90α抗体所识别,证明血浆中的Hsp90α是由胶质瘤细胞分泌而来的。5.血浆中的Hsp90α与胶质瘤病人其他临床病理指标无相关性研究患者年龄,肿瘤大小,ER和PR的含量对血浆中的Hsp90α浓度的影响。结果示这些病理指标对血浆中的Hsp90α浓度影响没有统计学意义(P)0.05)。[结论]Hsp90α可作为肿瘤特异性标志物,且含量与肿瘤恶性程度成正相关。第三部分肿瘤标志物Hsp90α促进胶质瘤转移的机理研究[目的]根据研究获知,Hsp90α能够促进胶质瘤的转移。本实验部分旨在研究Hsp90α促进胶质瘤转移的机理。[方法]通过免疫细胞荧光染色的方法检测出肿瘤细胞表面Hsp90α的浓度。通过激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察Hsp90α在细胞表面的位置。免疫荧光染色的方法检测细胞外基质降解与Hsp90α的共定位关系,细胞侵袭伪足与Hsp90α之间的共定位关系。通过免疫细胞荧光染色和免疫印迹的方法检测侵袭伪足相关调节因子对Hsp90α分泌的影响。体外侵袭伪足形成实验检测Hsp90α对侵袭伪足功能的影响。[结果]1. Hsp90α多分布于胶质瘤细胞的边界和突触上用免疫荧光技术测定细胞表面Hsp90α的分布,结果所示,在未包被细胞外基质的盖玻片上,肿瘤细胞表面Hsp90α分布较弥散,细胞浅染,提示细胞表面Hsp90α的分布无特异性并且含量较低。在被稀释后的Fibronectin预包被的盖玻片上,Hsp90α大多散在分布于细胞边缘,靠近细胞膜及突触部位。在被稀释后的Gelatin预包被的盖玻片上,肿瘤细胞膜表面的染色更增强,多位于细胞的边界和突触上。通过激光扫描共聚焦显微镜观察Hsp90α主要粘附于细胞连接处,即细胞与细胞外基质联结部位。免疫荧光染色的方法检测细胞外基质降解Hsp90α共定位。2. Hsp90α与胶质瘤细胞表面侵袭伪足的共定位荧光标记侵袭伪足的主要成分细胞微丝及侵袭伪足中常用的蛋白,结果示Hsp90α和细胞微丝中的细胞突触空间位置相吻合,与侵袭伪足中常用的蛋白有良好的共定位关系。3.侵袭转移的调节因子对Hsp90α分泌有影响将一些对胶质瘤细胞的侵袭有调节作用的因子,如c-Src、N-WASP和Cortactin,用免疫学实验的方法敲除,结果显示,敲除c-Src、N-WASP和Cortactin都能降低细胞表面Hsp90α的水平。4.Hsp90α能促进侵袭伪足降解细胞外基质用体外侵袭实验模拟胶质瘤细胞侵袭基底膜的过程,观察Hsp90α的抗体对细胞侵袭伪足形成的影响。结果示,Hsp90α的抗体对EGF诱导的侵袭伪足的形成有抑制作用。5.Hsp90α与侵袭伪足蛋白标记在人胶质瘤组织样本中的共定位用免疫细胞荧光法检测Hsp90α与肿瘤细胞侵袭伪足的共定位关系,结果示Hsp90α与Cortactin在人乳腺癌组织样本中共定位于肿瘤组织的侵袭部位前沿,具有共定位关系。[结论]肿瘤标志物Hsp90α促进胶质瘤转移主要是通过促进侵袭伪足的形成。论文总结1.Hsp90α的含量随胶质瘤细胞的恶性程度的增加而增加。2.Hsp90α具有促进胶质瘤细胞侵袭的作用。3.MMP-2对胶质瘤细胞的侵袭有协同作用。4.Hsp90α可作为肿瘤特异性标志物,且含量与肿瘤恶性程度成正相关。5.肿瘤标志物Hsp90α与侵袭伪足共定位。