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目的:本论文旨在研究一种新型Aurora A激酶抑制剂alisertib(ALS)联合Bcl-2抑制剂ABT-199对人双打击淋巴瘤(Double-hit lymphoma,DHL)细胞增殖、周期和凋亡的影响,并探索二者可能的协同作用机制,以期为DHL的联合靶向治疗提供理论依据,进而改善DHL患者的预后。方法:1、选取3株DHL细胞系ROS-50、DOHH2和VAL,采用MTS法检测不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)的ALS或ABT-199单药分别作用24、48和72h后对细胞增殖的影响;2、采用Graph Pad Prism 5.0软件分别计算两药的半数抑制率(IC50);3、将DHL细胞分为对照组(未处理组)、ALS组(加入各自1/5、2/5、3/5、4/5和5/5的IC50值)、ABT-199组(加入各自1/5、2/5、3/5、4/5和5/5的IC50值)和ALS+ABT-199组(浓度同单药组),作用48h后采用MTS法检测细胞的活力;4、应用Compu Syn软件计算联合指数(CI),分析两药相互作用是否具有协同效应;5、选取2/5 IC50浓度的ALS或/和ABT-199作用48h,PI单染后采用流式细胞术检测细胞周期的变化;6、选取3/5 IC50浓度的ALS或/和ABT-199作用48h,采用Annexin V/PI双染法和流式细胞术检测细胞凋亡率;7、采用Western blot分析ALS和ABT-199对靶蛋白MYC、Bcl-2、Aurka和p-Aurka,细胞周期蛋白Cyclin B1、CDK1、p21以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP表达的影响。8、采用SPSS 20.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)分析数据间差异。结果:1、浓度为0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ALS作用于3株DHL细胞24h的抑制率分别为0%、4.20%~10.95%、20.10%~35.87%、38.13%~48.50%、51.87%~71.37%;48h的抑制率分别为0%、14.70%~18.43%、48.80%~69.03%、67.70%~85.63%、79.70%~95.13%;72h的抑制率分别为0%、23.97%~31.20%、73.77%~83.33%、86.57%~94.43%、94.50%~97.03%。浓度为0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ABT-199作用于3株DHL细胞24h的抑制率分别为0%、11.62%~18.37%、40.70%~54.33%、55.27%~83.41%、64.53%~95.25%;48h的抑制率分别为0%、24.77%~32.60%、55.73%~61.17%、77.53%~89.23%、92.57%~96.48%;72h的抑制率分别为0%、31.47%~43.80%、65.93%~76.12%、86.13%~97.67%、94.90%~101.37%。2、单药ALS作用ROS-50、DOHH2和VAL细胞24h的IC50值分别为:3082n M、1280 n M、1452 n M;48h的IC50值分别为:49 n M、124 n M、108 n M;72 h的IC50值分别为:22 n M、28 n M、16 n M。单药ABT-199作用ROS-50、DOHH2和VAL细胞24h的IC50值分别为:408 n M、152 n M、120 n M;48 h的IC50分别为:72 n M、60 n M、43 n M;72 h的IC50分别为:28 n M、17 n M、13 n M。3、联合用药组(1/5、2/5、3/5、4/5和5/5 IC50)对ROS-50细胞的抑制率分别为:(43.50±3.54)%、(55.50±2.12)%、(69.53±5.18)%、(82.35±0.92)%、(86.74±1.77)%;对DOHH2细胞的抑制率分别为:(36.25±3.85)%、(52.75±2.05)%、(71.95±4.31)%、(82.65±3.61)%、(92.40±1.70)%;对VAL细胞的抑制率分别为:(38.45±3.18)%、(56.55±2.89)%、(68.40±2.41)%、(76.34±3.18)%、(82.57±2.76)%。4、Compu Syn软件计算结果显示ALS联合ABT-199有协同抑制DHL细胞增殖的作用(CI<1)。5、ALS联合ABT-199协同促进DHL细胞阻滞在G2/M期:经2/5 IC50浓度药物处理48h后,ROS-50细胞对照组、ALS组、ABT-199组和ALS+ABT-199组的G2/M期比例分别为:(13.09±2.94)%、(23.98±1.11)%、(15.95±3.48)%、(37.59±3.96)%;DOHH2细胞G2/M期的比例分别为:(17.62±4.62)%、(22.53±1.91)%、(19.04±4.05)%、(35.63±2.68)%;VAL细胞G2/M期的比例分别为:(11.67±1.20)%、(22.94±1.66)%、(16.09±3.19)%、(30.94±3.14)%。6、ALS联合ABT-199协同诱导DHL细胞凋亡:经3/5 IC50浓度药物处理48h后,ROS-50细胞对照组、ALS组、ABT-199组和ALS+ABT-199组的凋亡率分别为:(3.03±1.04)%、(15.39±1.96)%、(16.32±2.59)%、(51.98±2.73)%;DOHH2细胞的凋亡率分别为:(2.23±0.67)%、(16.33±2.19)%、(17.33±4.29)%、(47.50±5.86)%;VAL细胞的凋亡率分别为:(3.27±0.93)%、(16.47±2.33)%、(15.06±1.05)%、(43.70±6.16)%。7、Western印迹结果显示:单药组和联合组Bcl-2蛋白表达与对照组相比无明显变化,这是由于ABT-199的作用机理是拮抗Bcl-2的功能,而非降低其蛋白表达;Aurka总蛋白水平变化没有趋势,磷酸化Aurka在ABT-199处理后水平有轻微下降,ALS处理后表达明显减少,两药联合作用则基本被完全抑制;ALS抑制MYC的表达可以在DOHH2细胞中观察到;ALS和ABT-199通过下调Cyclin B1和CDK1的表达,并上调p21的表达,使DHL细胞阻滞在G2/M期;ALS联合ABT-199促进Caspase-3活化和PARP剪切,提示两药联合诱导凋亡启动了线粒体凋亡途径。结论:1、ALS和ABT-199单药对3株人DHL细胞均具有抑制细胞增殖的作用,并呈剂量和时间的依赖性。2、ALS联合ABT-199对DHL细胞活力的抑制具有协同效应,明显强于两种药物的单独作用;3、较低浓度(2/5 IC50)作用下,ALS联合ABT-199可协同诱导DHL细胞阻滞在G2/M期(P<0.05)。4、较高浓度(3/5 IC50)作用下,ALS和ABT-199联合用药可协同诱导DHL细胞的凋亡(P<0.01)。5、ALS和ABT-199联合用药可明显减少p-Aurka蛋白的表达,Aurka总蛋白和Bcl-2蛋白表达无明显变化。6、ALS和ABT-199通过下调Cyclin B1和CDK1的表达,并上调p21的表达,使DHL细胞阻滞在G2/M期。7、ALS联合ABT-199诱导的细胞凋亡是通过内源性凋亡途径介导的。综上,ALS联合ABT-199具有协同的抗DHL细胞增殖的效应,其机制包括协同诱导细胞G2/M期阻滞、激活内源性细胞凋亡信号通路和抑制Aurka的激酶活性。