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一氧化氮(nitric oxide, NO)既兼有第二信使和神经递质的功能,又是效应分子,介导和调节多种生理和病理过程[1,2]。NO的调节功能十分广泛,除了舒张血管,它还在血小板聚集,血管生成,血管平滑肌细胞的增值等方面发挥作用[3,4]。当内皮要向肌肉发出放松指令以促进血液流通时,就会产生小分子NO,它能很容易地穿过细胞膜,血管周围的平滑肌细胞接收信号后舒张,从而导致血管扩张。因此,正常生理条件下,NO在维持心血管系统稳态方面起着十分重要的作用[5]。近年来的研究发现,在几乎所有病理条件下,都伴随着内皮功能紊乱以及NO含量的异常[6]。人体内NO主要来源于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS),其同功酶有三种亚型,即在正常状态下表达的内皮型一氧化氮合酶(eNOS),神经元型一氧化氮合酶(nNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。作为水溶性可扩散的气体分子,NO在心血管系统不能像其他信号分子一样储存在细胞器。它的产生取决于eNOS的活化,其信号强度和作用时间长短很大程度上取决于eNOS的功能状态。因此,eNOS的激活与调控机制已经成为国际上心血管领域的研究热点。经典理论认为,eNOS需要在钙调蛋白(CaM)结合变构之后才能活化,而后者需要在Ca2+浓度升高的条件下发生变构才能与eNOS结合[10，11]。细胞内Ca2+来源有两条途径：(1)、乙酰胆碱、缓激肽等激动剂与细胞膜上的G蛋白偶联受体结合,钙通道开放,胞外Ca2+流入胞浆[12]；(2)、ATP结合内质网P2Y受体,促进钙库Ca2+释放[13]。细胞浆内Ca2+浓度升高,CaM与Ca2+结合形成Ca2+/CaM复合物,eNOS与后者结合后构象变化,使得电子流可以从还原亚基转移至氧化亚基,催化NO的生成。除了Ca2+调控之外,蛋白质的磷酸化修饰在eNOS活性调控中也起着非常重要的作用[14]。近年来的研究发现,eNOS在丝氨酸和苏氨酸残基上容易被磷酸化,己知的对eNOS功能起关键作用的是Ser1179/1177(牛.人)。目前报导的激酶包括Akt、AMPK、PKG.CaKII等都能够磷酸化该位点,许多胞外刺激信号都可磷酸化该位点而激活eNOS。与此同时,Ser635是eNOS的另一个重要磷酸化位点,在机械剪切力作用下,PKA对Ser635位点的磷酸化显著地增强了eNOS活性[17]。与上述两个位点磷酸化均可增强eNOS活性相反的是,由PKC激活的Thr497的磷酸化能够降低eNOS的酶活性[18-20]。除了Ser1179/Ser635/Thr497之外,其它被报导的磷酸化位点还有Ser116和Ser617.相对于前三个位点来说,Ser116和Ser617位点磷酸化对于eNOS功能的影响还有待进一步研究。尽管Ca2+和蛋白质磷酸化修饰这两种因素在调控eNOS舌性方面都起着重要的作用,但它们二者之间的相互作用目前知之甚少。我们前期的工作和最新研究资料表明：尽管CaM的结合对于eNOS活化及其重要,但是二者的结合是否一定需要高浓度的Ca2+呢?这取决于eNOS磷酸化的状态。例如,在静息水平的Ca2+浓度下,Serl 179/Ser635位点的磷酸化能够激活eNOS。显然,正是因为这两个位点的磷酸化增强了eNOS与CaM之间的亲和力[22]。另一方面,细胞内的Ca2+位移如何影响eNOS的磷酸化呢?目前仍不清楚。在本研究中我们首次发现TG(Thapsigargin)刺激BAEC和HUVEC两种细胞,引起eNOS活化,产生NO增加现象。进一步研究发现,eNOS在Ser635位点特异性磷酸化,并且呈现时间和剂量依赖性,在半小时点达到峰值,同时我们发现这种激活作用与细胞外液Ca2+无关。因此,我们推测可能是细胞动员了钙库中的Ca2+,导致细胞浆中Ca2+浓度升高,从而激活了eNOS.通过进一步分析,我们使用了不同的钙释放剂,包括Bradykinin和ATP同样检测到了eNOS在Ser635位点的特异性磷酸化,使用细胞内钙抑制剂]Bapta-AM有效阻止了该磷酸化修饰。这进一步证明了我们的猜测：细胞内Ca2+浓度升高导致了eNOS磷酸化。接着,我们探究了细胞内Ca2+浓度升高与eNOS磷酸化二者之间的关系和信号转导机制。据现有报导,许多刺激信号能够通过PKA、CaMKII等信号途径在eNOS的Ser635位点进行磷酸化修饰,从而活化eNOS,增强其产生NO的能力。我们的研究显示：PKA的特异性抑制剂PKI、H89以及CaMKII的特异性抑制剂KN93均不能阻止eNOS在Ser635位点特异性磷酸化。而使用ERK1/2的特异性抑制剂PD98059和U0126均可完全阻止eNOS在Ser635位点特异性磷酸化。这些结果表明：eNOS在Ser635位点特异性磷酸化机制与PKA、CaMKII无关,而是由ERK1／2信号转导通路所介导。综上所述,在本研究中我们发现了内质网钙释放激活了eNOS在Ser635位点特异性磷酸化,增强了eNOS的酶活性。同时,我们揭示了该信号通路系由上游激酶ERK1／2介导的生化机制。并且,我们进一步阐述了在生理条件下,ATP通过ERK1／2信号途径对Ser635位点特异性磷酸化,从而激活eNOS的调控机制。