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奶牛乳腺炎是一种常见的症状之一,受遗传、环境等多种因素的控制,具有复杂性、多样性及难愈性等特点,在其发生过程中有多种免疫相关基因参与。CXCL10属于CXC趋化因子超家族的非ELR类,参与多种自身免疫性疾病。CXCL10在中性粒细胞,树突细胞,单核细胞,上皮细胞,内皮细胞,纤维细胞等细胞表达,主要介导Thl型炎性反应,趋化趋化白细胞向炎症部位聚集,可加强Thl反应的进程,破坏Th2反应的进程。借助分子生物学手段,对此基因从启动子、miRNA以及SNP等水平上,筛选可用于乳腺炎抗性/易感性的功能性SNPs,并探索基于这些功能性SNPs的分子调控机理。主要研究结果分述如下:1.CXCL10基因的表达利用平板稀释计数法培养标准菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌),并分别计算其单位体积中活菌的个数(CFU)。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别以与RAW 264.7细胞的倍数为:5、15、25、35、45、55和65,感染细胞1h。提取细胞中的RNA,进行荧光定量PCR。通过荧光定量PCR发现,无论高浓度还是低浓度菌液感染,CXCL10 mRNA的表达量均增加,并且其表达量随着菌液浓度的增加而升高。同时提取健康(n=5)和患有乳腺炎(n=5)牛静脉血中的中性粒细胞,再提取RNA,进行荧光定量PCR,发现患有乳腺炎个体中CXCL10 mRNA的表达量显著高于健康个体(P<0.05),表明CXCL10参与乳腺炎的发生过程,并在免疫过程中发挥重要的作用。2.CXCL10基因核心启动子活性分析及功能SNPs的鉴定首先利用在线软件Genomatix预测基因CXCL10的启动子区(g.-602~g.+102),然后将不同长度的启动子片段(pGL3-1183,pGL3-958,pGL3-669和pGL3-377)构建到pGL3-Basic荧光素酶报告表达载体,经过瞬时转染和双荧光素酶活性测定,鉴定了CXCL10基因核心启动子区位于g.-377~g.-1。对核心启动子区域进行生物信息学分析,发现该区域存在许多转录因子结合位点,如OCT1,E2F和HNF1等,这些转录因子可能在CXCL10基因转录过程中发挥着至关重要的作用。PCR扩增和序列比对后发现CXCL10基因核心启动子区域存在2个完全连锁的SNPs(g.-324 C>A和g.-163 C>T),并也通过载体构建,瞬时转染和双荧光素酶活性测定发现突变型的启动子活性显著高于野生型(P<0.05)。软件分析发现野生型增加了HNF1转录因子结合位点。对SNP(g.-324 C>A和g.-163 C>T)进行基因分型,并将其和SCS进行关联分析,发现该位点的突变型型个体具有较低的SCS。3.CXCL10基因3’UTR和bta-miR-339相关性研究利用PCR和序列比对的方法发现在CXCL10基因3’UTR区域存在一个SNP(g.+1642A>G)。通过RNA hybrid和RNA 22靶标预测软件发现bta-miR-339可以结合,且发现bta-miR-339对CXCL10基因3’UTR区野生型和突变型的结合能力存在明显不同,对此SNP进行关联性分析发现突变型(GG)具有较低的体细胞评分(SCS)(P<0.05)。将含有野生(AA)基因型和突变(GG)基因型的3’UTR中的355bp片段分别连接到PMIR-ReportTM Luciferase表达载体中,和bta-miR-339真核表达载体共转染293T细胞。通过双荧光素酶表达量分析,发现突变(GG)基因型显著降低了bta-miR-339与CXCL10基因3’UTR区域的结合能力,同时发现bta-miR-339可以降低CXCL10基因的表达。提取分别具有GG、AG和AA基因型个体乳腺组织中的总RNA,通过RT-PCR和RT-qPCR发现基因型AA个体中CXCL10 mRNA的表达量显著低于其他基因型(P<0.05)。对SNP g.+1642 A>G进行基因分型,并将其和SCS进行关联分析,发现该位点的AA型个体具有较低的SCS。同时,本研究将CXCL10基因核心启动子区和3’UTR区域的SNPs进行单倍型组合关联分析,发现H1H1,H2H4和H3H4单倍型组合相比于其它单倍型组合表现出较低的SCS(P<0.05)。综上所述,本研究选取CXCL10作为奶牛乳腺炎抗性候选基因,应用PCR和PCR-RFLP手段,进行目标基因及调控元件的克隆、SNP筛查及相关性分析,筛选到显著影响奶牛乳腺炎的分子标记。应用生物信息学预测了目标基因的启动子区及靶标mi RNA,并通过细胞水平的转染实验,初步证实了新发现的分子标记的作用机理,为奶牛乳腺炎抗性的分子标记辅助选择奠定理论基础。