骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是继胚胎干细胞后备受关注的干细胞，由于这些细胞很容易在塑料器皿表面贴壁生长形成细胞群落，曾被称为贴附塑料细胞，因其存于骨髓基质中又命名为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是中胚层来源的具有多向分化潜能的干细胞，具有向骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、脂肪细胞、造血细胞和神经细胞等分化的特性。它性能稳定，增殖速度快，容易获取，能够进行白体移植，避免了其它干细胞移植时存在的伦理问题，同时能直接或间接抑制T淋巴细胞的功能，降低了免疫排斥，免疫原性较弱，使BMSCs可应用于同种异体移植。因此，BMSCs可作为一种潜在自体移植的细胞来源。　　 近年来，人们越来越关注BMSCs，一些研究显示，骨髓间充质干细胞在适当培养条件下具有体外分化成为表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的星形胶质细胞或表达神经特异性核蛋白(NeuN)的神经元样细胞的潜力；骨髓间充质干细胞还分泌多种神经营养因子和细胞因子可能有助于防止脑损伤后神经细胞凋亡或丢失。移植进入脑组织之后，BMSCs长期生存，并能分化成神经细胞，以取代受损的神经细胞。BMSCs还能触发内源性神经元生存信号通路，减少神经细胞凋亡；BMSCs能创造良好微环境，促进内源性神经祖细胞的增殖，促进内源性少突胶质细胞的增殖，创造细胞桥梁和‘指导链’，增强星形胶质细胞间的沟通，能促进纤维连接蛋白产生来抵消胶质瘢痕，从而降低胶质瘢痕厚度；BMSCs促进脑血液循环，修复血脑屏障，减轻脑水肿，减低颅内压；BMSCs促进中枢的少突胶质细胞和外周雪旺氏细胞增生，减少脱髓鞘；BMSCs还能和临近的神经细胞融合。由于上述多种机制综合，BMSCs修复脑损伤的神经功能有比较好的效果。　　 因此，移植BMSCs是一种很有前途治疗脑损伤策略。而且临床上已经有人用自体的BMSCs来治疗脑损伤，然而，BMSCs移植入大脑后，骨髓间充质干细胞在局部存活率很低，只有万分之几，从而使现有的策略受到限制。那么，如何提高BMSCs的成活率是必须解决的问题。　　 有报道显示BMSCs在神经营养因子的诱导下分化为nestin阳性细胞后，比没有诱导的BMSCs能更好修复神经功能。BMSCs表达NGF和BDNF降低，TrkA和TrkB的表达会受限制。有趣的是，p75NTR在未分化的BMSCs不表达，但在神经分化诱导后开始表达，然后在完全分化为神经元样细胞时又不表达。神经营养因子诱导BMSCs向神经祖细胞分化，从而更好地修复神经功能，其机制可能是因为神经营养因子与受体(TrkA、TrkB、p75NTR)结合，启动BMSCs的存活信号通路，提高成活率来实现的。但是BMSCs分泌微量的神经营养因子不足以诱提高BMSCs成活率。又有人报道可以通过改变局部理化环境，BMSCs改变基因表达谱，促进BMSCs在移植局部的存活，从而有更多的干细胞发挥作用，保护宿主组织。因为BMSCs表达受体(TrkA、TrkB、p75NTR)，而局部理化环境可以调控BMSCs的存活。所以我们假设提高局部环镜的NGF的量能促进BMSCs在脑内存活，从而达到更好的治疗效果。为了使NGF长期作用于BMSCs，我们采用分子生物学技术，用NGF基因修饰BMSCs，BMSCs是很好的基因修饰的载体，基因修饰后，干细胞特性不变。本研究探讨NGF基因修饰的BMSCs在穹隆海马伞损伤模型脑内的存活，分化，以及它治疗效果。　　 全文包括三大部分：　　 1.神经生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞。　　 2.探讨NGF基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑内存活、分化。　　 3.探讨NGF基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗穹隆海马伞损伤大鼠的效果评价。　　 1.神经生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞。　　 1.1 NGF cDNA的合成　　 根据Gene Bank大鼠NGF的cDNA功能全长序列(Gene ID：310738)，采用Primer5.0设计-对引物，并插入BamH I和Hind IIT酶切位点。由Invitrogen公司合成，其序列如下：Sense：5’-GC AAGCTTATGGCCTGTGGTCGTGCAGTCCAGGGGGCTGGATGG-3’:Antisense:5’-GCGGATCCCTGCCTCTTCTTGCAGCC-3’。　　 采用TRIzoTMRNA抽提试剂盒进行SD成年大鼠脑中海马总RNA抽提。再用逆转录合成NGF cDNA，然后以此合成产物为模板，加入NGF基因特异引物进行PCR扩增。PCR产物用1％的琼脂糖疑胶电泳检测。观察到NGF特异条带，大约882bp，未见明显杂带，PCR产物具有较好的特异性。　　 1.2 NGFcDNA片段和pLEGFP-N1载体片段进行连接成重组质粒PLEGFP-NGF。　　 1.3重组质粒pLEGFP-NGF的鉴定：　　 限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切分析，出现正确的条带，可见6891bp和882bp大小的两条条带，一条是pLEGFP-N1载体的条带，一条是NGF条带。　　 1.4 pLEGFP-NGF序列分析：　　 对pLEGFP-NGF重组质粒进行测序，测序结果表明pLEGFP-NGF重组质粒序列无错误，无读码框改变，终止密码和起始密码子的位置正确。NGF序列与GENE BANK中的rat-NGF序列比对显示：Score=1619 bits(842)，Expect=0.0，Identities=863/864(99％)，Gaps=1/864(0％)，Strand=Plus/Minus。　　 1.5 pLEGFP-NGF重组质粒的包装　　 pLEGFP-NGF重组质粒转染到293T细胞，转染24小时后，293T细胞出现绿色荧光蛋白基因的表达，在荧光显微镜下观察到80％细胞有明显的绿色荧光，说明重组质粒转染到293T细胞成功。将收集所得病毒上清置-70℃冻存备用。同时测定重组逆转录病毒滴度，病毒滴度约为1×107 pfu/ml。　　 1.6骨髓间充质干细胞的培养、纯化、扩增：　　 冲洗出来的骨髓细胞在培养瓶底散在分布，都呈圆形，其中造血细胞占多数，培养1-2天后这些造血细胞逐渐破碎，数次换液后可清除这些造血细胞。一般在原代细胞培养48小时换液，可见量少的贴壁细胞，此时的贴壁细胞都是单个或细胞克隆，有较大的突起。培养第2到第4天，细胞增殖缓慢，细胞数变化不明显，5-10天细胞快速增殖，大概11-13天后，细胞融合成单层，细胞呈纺锤，排列有方向性，细胞排列呈网状、放射状。待细胞90％融合时传代。本研究用第5-第8代的BMSCs。　　 1.7 BMSCs的表型分析　　 流式细胞仪分析第2代的BMSCs的表型，结果显示，BMSCs具有较高的的均一性，第二代细胞92.37％ CD45阴性，证明这类细胞为非造血干细胞，95％以上的细胞表型为CD29、CD44阳性。　　 1.8病毒上清感染BMSCs　　 病毒上清转染24小时后，BMSCs出现绿色荧光蛋白基因的表达，在荧光显微镜下40％-50％的BMSCs显现明亮的绿色荧光。经过两周G418的筛选，90％以上的BMSCs显现绿色荧光。提示pLEGFP/NEF重组质粒成功转入靶细胞(BMSCs)。　　 1.9检测NGF在BMSCs中的表达　　 由于报告基因可与目的基因融合表达，可通过观察绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达，提示目的基因NGF在BMSCs中是否表达。90％以上的BMSCs显现绿色荧光。细胞生长迅速，NGF基因修饰后没有影响BMSCs的增殖速度。　　 Western blot检测体外培养BMSCs中的NGF的表达：检测空载体组和NGF组NGF的表达情况，用已知的NGF蛋白做阳性对照。用GAPDH作为内参。在NGF蛋白阳性对照栏和NGF组栏中均出现特异条带，分子量都约为13.2 KDa，而在空载体组并未出现相应的特异条带。表明NGF基因修饰的BMSCs能分泌NGF蛋白，而空载体组未检测到NGF分泌。　　 2.探讨NGF基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑内存活、分化　　 2.1观察移植的细胞在脑内的分化状况　　 移植2周后，通过荧光显微镜可以观察到在移植针道的附近有很多存活的细胞。未见BMSCs分化为神经样细胞，存活细胞的形态小圆形，没有极性，和周边的组织相容性很好，未见有病理改变形态学征象。同时用红色的荧光标记NGFR阳性细胞和GFAP阳性细胞，有趣的是有细胞融合现象发生，GFP阳性细胞与NGFR阳性细胞或GFP阳性细胞与GFAP阳性细胞形成融合，形成多核细胞。　　 2.2 Western blot检测外源性的NGF在表达的情况　　 选择移植后第2、4、6、8周这四个时间点来追踪外源性NGF的表达。第二周时NGF的表达是最强的，以后逐渐减弱，到第8周只有微量表达，外源性的NGF在脑内持续表达大约8周。　　 3.评价NGF基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗穹隆海马伞损伤大鼠的效果。