背景与目的宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一,在导致妇女死亡的恶性肿瘤中占第二位。据统计,全球每年大约有50万左右宫颈癌新发病例,占所有癌症新发病例的15%。研究表明,高危型人乳头状瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病原因,但感染者最终仅有小部分发展为宫颈癌,因此还存在其他因素在宫颈癌的发生中发挥独立或协同高危HPV致病的作用,其具体机制至今未明。此外,早期宫颈癌患者经手术和/或放疗效果显著,但对于晚期患者目前仍缺乏有效的治疗方法。因此,对宫颈癌分子生物学基础进行深入研究尤为重要。同源盒基因是一类具有特定时空表达模式的转录调控因子,可特异性地调节基因的表达,在细胞生长、分化、增殖、凋亡、黏附和迁移中起重要作用,不仅能控制胚胎细胞的发育、分化及细胞周期进程,而且可诱导细胞恶性转化、增殖,并出现侵袭性,导致肿瘤发生发展,目前已成为发育生物学和肿瘤学领域的研究热点。Six1基因是新近发现的一个同源盒基因,定位在人染色体14q23上,其编码的蛋白质是由一个183bp的高度保守的同源异型结构域(homeodomain, HD, 61个氨基酸)和Six结构域(Six domain, SD, 110-115个氨基酸)组成的复合结构,该结构与DNA结合的特异性决定了其靶基因的特异性,为脑、耳、眼、肌肉和肾等多种组织器官发育所必需。当Six1调控异常时,不仅可引起胚胎发育和组织器官形态结构异常、胚胎死亡,而且在肿瘤发生和转移中发挥着关键作用。研究显示,作为细胞周期调节器,Six1可活化细胞周期调节因子,促进细胞分化、增殖,同时其自身调节也贯穿在整个细胞周期中。Six1是E2F1的转录靶基因,在G1/S期转录激活,S期转录水平增加,有丝分裂后期降解,因此,Six1的转录活性一般在G1/S期到有丝分裂早期。通过激活靶基因细胞周期素A1(CyclinA1)、CyclinD1等,确保细胞周期的顺利进行,而Six1的过度表达则削弱了这一作用,加速细胞周期进程,造成细胞无限增殖,导致肿瘤的发生。在不同的肿瘤中,Six1的作用靶点有所不同,乳腺癌中CyclinA1是Six1的下游效应分子,Six1过表达促进了CyclinA1表达,加速细胞增殖,同时也影响了细胞存活、DNA修复和血管生成。在横纹肌肉瘤中,过表达的Six1则可激活几种癌基因包括CyclinA1、CyclinD1和Ezrin,并通过Ezrin来促进转移的发生。在卵巢癌中,Six1过表达通过促进CyclinA表达增加,促进细胞增生,并且Six1表达程度与卵巢癌患者分期和预后有关,分期越晚,表达越高,预后越差。但Six1在宫颈癌发生发展中的作用目前尚无报道。研究表明,CyclinA1、CyclinD1等在正常宫颈组织中呈低表达或不表达,在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中表达逐渐升高,提示它们在宫颈癌的发生发展中有一定的作用,并认为这些细胞周期调节因子水平的改变可能成为宫颈癌早期诊断及判断预后的指标。此外,Ezrin在宫颈癌中的过表达与宫颈癌细胞的侵袭转移密切相关,这些结果为我们研究Six1在宫颈癌发生发展中的作用及其机制提供了理论依据。因此,本研究拟先从细胞和组织方面探讨Six1的表达情况,然后通过正、反义腺病毒载体的构建来深入研究Six1表达变化对宫颈癌细胞增殖侵袭行为及其对下游相关基因的影响,以探讨Six1基因在宫颈癌发生发展中的作用及其调控机制。本研究的主要结果和结论如下:1.Six1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌组织中的表达呈由不表达或弱表达到强表达的逐渐变化趋势,通过观察Six1在不同分期宫颈鳞癌组织中的表达变化,发现分期越晚,Six1表达越强,同时在有淋巴结转移组中的表达明显高于无淋巴结转移组。利用宫颈癌细胞株进行的研究则显示:Six1在三种宫颈癌细胞株(CaSki、HeLa、C33A)中均有不同程度过表达,其中CaSki、HeLa中的表达高于C33A,以上结果提示:Six1在宫颈癌发生发展、侵袭转移中具有重要作用。2. Six1正、反义腺病毒载体感染宫颈癌细胞后细胞形态无明显改变,并能显著上调或下调Six1的表达水平,说明编码人Six1正、反义腺病毒载体构建成功,为后续的Six1的功能研究奠定了基础。3.上调Six1表达可使宫颈癌细胞的G2/M期缩短,增殖加快,侵袭能力增强,而干扰Six1表达则使细胞周期阻滞在G2/M期,宫颈癌细胞增殖速度减慢,侵袭力下降,提示Six1的表达变化可影响宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。4.裸鼠皮下注射转染反义Six1基因的宫颈癌细胞,形成的肿瘤生长缓慢,体积明显小于其它两个对照组,肿瘤抑制率则显著大于空载体对照组。以上结果表明,通过下调Six1表达可对裸鼠宫颈癌肿瘤的生长产生良好的抑制作用。5.上调Six1表达可使宫颈癌细胞Cyclin A1、Cyclin D1和Ezrin的表达升高,而干扰Six1表达则可下调宫颈癌细胞Cyclin A1、Cyclin D1和Ezrin的表达,提示Cyclin A1、Cyclin D1和Ezrin可能是Six1调控宫颈癌细胞生物学功能的重要靶基因。本研究工作首次探索了Six1在宫颈癌细胞中的生物学功能以及对下游靶基因影响,不仅为开拓Six1在肿瘤学领域的研究提供了有益的信息,而且为阐明宫颈癌的发病机制和防治策略提供了全新的视角。