帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是锥体外系功能紊乱引起的一种仅次于阿尔茨海默症的全球第二大神经退行性疾病,主要临床症状表现为运动迟缓、静止性震颤、肌僵直等,病情呈慢性进行性加重,严重影响老年人的身心健康和生活质量。研究报道指出,PD可能的发病机制包括：老化、环境因素、线粒体功能障碍、氧化应激以及炎症反应等,这种发病机制的多样性制约着PD理想治疗药物的研发和临床治疗学的突破。目前临床主要应用左旋多巴(levodopa, L-DOPA)替代治疗,尽管能够缓解大多患者的症状,却不能阻止黑质多巴胺能(DAnergic)神经元进行性凋亡、坏死的病理进程,长期应用还可产生运动障碍等严重并发症。因此,加强对PD病理机制的探讨,发现能够延长多巴胺能神经元存活的关键靶标,研发理想的神经保护剂已经成为PD研究最重要的研究目标之一。PD的典型病理特征是中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺能神经元进行性变性坏死,路易小体(Lewy body,LB)沉积及小胶质细胞的过度活化。小胶质细胞的活化主要分为两种表型即经典激活M1表型和替代激活M2表型。M1表型小胶质细胞激活主要产生大量的致炎因子,引起炎症反应,促进多巴胺能神经元的变性坏死,在PD的病理进程中起着关键的作用,是PD的重要病理机制；M2表型小胶质细胞激活主要分泌抗炎及营养因子,表现为抗炎及组织修复作用,对维持疾病早期神经元的存活及内环境的稳定至关重要。在PD的整个病理过程中,小胶质细胞的激活形式随着疾病进程发展而有所转化,发挥保护或损伤作用。因此,加强对小胶质细胞表型转化机制的探讨,发现能够促进小胶质细胞由神经毒性的M1型向神经保护的M2型转变的关键靶标,研发理想的神经保护剂将成为未来治疗PD的一个新方向。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel, K-ATP)是一种耦联细胞代谢与电活动、非电压依赖性的特殊钾离子通道,由内向整流钾通道(inwardly rectified potassium channel, Kir)和磺酰尿类受体(sulfonylureas, SUR)按照4：4比例组成的异源八聚体(SUR/Kir6.X),广泛分布于机体的多种器官和组织。本实验室前期研究发现K-ATP通道与PD的发生发展相关,提出K-ATP通道可能是研发理想神经保护剂的重要靶标。同时发现,小胶质细胞表达Kir6.1/SUR2构成的功能性K-ATP通道,且通道开放可显著抑制小胶质细胞的活化和炎性因子的释放,对鱼藤酮模型大鼠的黑质DA神经元呈现显著的保护作用,提示表达在小胶质细胞的Kir6.1/K-ATP通道可能参与调节小胶质细胞表型变化,参与PD发生发展。基于此,本文第一部分工作应用Kir6.1敲减小鼠、星形胶质细胞Kir6.1敲除小鼠、小胶质细胞Kir6.1敲除小鼠分别制备MPTP亚急性模型,观察Kir6.1敲减、星形胶质细胞Kir6.1敲除以及小胶质细胞Kir6.1敲除对MPTP亚急性模型小鼠中脑胶质细胞活化和神经损伤的影响。研究结果表明,Kir6.1敲减加重MPTP引起的小鼠中脑神经损伤,星形胶质细胞特异性敲除Kir6.1对MPTP引起的小鼠中脑神经损伤无显著性影响,小胶质细胞特异性敲除Kir6.1加重MPTP引起的小鼠中脑神经损伤。基于第一部分研究发现小胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥重要作用,第二部分工作主要通过干扰BV2细胞内Kir6.1表达,观察其对LPS联用IFN-γ引起的小胶质细胞向M1表型转化和IL-4引起的小胶质细胞向M2表型转化的影响。研究结果表明, BV2内Kir6.1表达下调加剧LPS联用IFN-y引起的小胶质细胞向M1表型的转化,抑制IL-4引起的小胶质细胞向M2表型的转化；Kir6.1过表达则可以抑制LPS联用IFN-y引起的小胶质细胞向M1表型的转化,促进IL-4引起的小胶质细胞向M2表型的转化；Kir6.1参与LPS联用IFN-y引起的小胶质细胞向M1表型转化或许与p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路有关。基于此,第三部分的研究工作应用相关信号通路工具药物,观察对BV2内Kir6.1下调加剧的小胶质细胞炎症反应引起的神经损伤的影响,进一步明确Kir6.1/K-ATP通道调控小胶质细胞极化的作用机制。此外,我们应用Kir6.1敲减小鼠制备脂多糖(LPS)炎性PD模型,观察p38抑制剂SB203580对LPS引起的Kir6.1¨小鼠中脑小胶质细胞活化和神经损伤的影响,进一步确证Kir6.1/K-ATP通道调控小胶质细胞表型转化参与PD发生发展的机制。研究结果表明,SB203580可以显著减轻LPS引起的Kir6.1+／-小鼠中脑小胶质细胞的增殖活化和DA神经元的丢失。综上所述,Kir6.1/K-ATP通道调控p38 MAPK信号通路介导小胶质细胞表型转化,参与PD发生发展。第一部分Kir6.1/K-ATP通道在MPTP所致小鼠中脑神经损伤和胶质细胞活化中的作用目的：应用Kir6.1敲减小鼠、星形胶质细胞Kir6.1敲除小鼠、小胶质细胞Kir6.1敲除小鼠,研究Kir6.1/K-ATP通道对MPTP亚急性模型小鼠中脑神经损伤的调节作用。方法：应用3月龄野生型(wild type,WT, Kir6.1+/+)及Kir6.1杂合子(Kir6.1 heterozygote, Kir6.1+/-)雄性小鼠,MPTP皮下注射,继而丙磺舒腹腔注射(MPTP 20 mg/kg,s.c.,丙磺舒250 mg/kg,i.p.,一日一次,连续5日)建立MPTP亚急性模型。应用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)及电离钙离子结合蛋白1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,IBA-1)免疫组织化学染色法结合体视学计数观察小鼠中脑SNpc区DA神经元的损伤、星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化；应用RT-PCR方法检测小鼠中脑细胞因子TNF-α、IL-1β、iNOS和CCL3以及Arg-1、CD206和YM-1 mRNA水平变化。应用Cre-LoxP系统构建星形胶质细胞Kir6.1特异性敲除小鼠和小胶质细胞Kir6.1特异性敲除小鼠。确定构建成功后,对星形胶质细胞Kir6.1特异性敲除小鼠进行MPTP亚急性模型的制备,应用免疫组织化学法和体视学计数方法观察星形胶质细胞特异性敲除Kir6.1对MPTP引起的小鼠中脑SNpc区DA神经元丢失、星形胶质细胞和小胶质细胞增殖活化的影响。对小胶质细胞Kir6.1特异性敲除小鼠进行MPTP亚急性模型的制备,应用免疫荧光双标的方法观察小胶质细胞特异性敲除Kir6.1对MPTP引起的小鼠中脑SNpc区DA神经元损伤和小胶质细胞增殖活化的影响。结果：1)基础状态下,Kir6.1+/+和Kir6.1+/-两种基因型小鼠SNpc区TH神经元数目无显著性差异；MPTP亚急性模型制备后,两种基因型小鼠SNpc区TH神经元均显著性丢失,且Kir6.1+/-小鼠的丢失更为显著。2)基础状态下,Kir6.1+/+和Kir6.1+/-两种基因型小鼠SNpc区胶质细胞数目无显著性差异；MPTP亚急性模型制备后,两种基因型小鼠SNpc区胶质细胞显著性增殖活化,且Kir6.1+/-小鼠小胶质细胞的增殖活化更为显著。3)基础状态下,Kir6.1+/+和Kir6.1+/-两种基因型小鼠中脑TNF-α、IL-1β、CD206和YM-1等细胞因子mRNA水平无显著差异；MPTP亚急性模型制备后,两基因型小鼠中脑TNF-α、IL-1β、iNOS和CCL3 mRNA水平显著增加,Arg-1、CD206和YM-1 mRNA水平显著降低,且Kir6.1+/-小鼠中脑mRNA水平变化得更为显著。4)基础状态下,Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPCre/+两种基因型小鼠SNpc区TH神经元数目、星形胶质细胞和小胶质细胞的数量无显著性差异；MPTP亚急性模型制备后,两种基因型小鼠SNpc区TH神经元均显著性丢失,星形胶质细胞和小胶质细胞均显著性增殖活化,但两基因型间不存在显著性差异。5)基础状态下,Kir6.1loxp/loxp和Kir61loxp/loxpCD11bCre/+两种基因型小鼠SNpc区TH神经元数目和小胶质细胞的数量无显著性差异；MPTP亚急性模型制备后,两种基因型小鼠SNpc区TH神经元显著性丢失,小胶质细胞显著性增殖活化,且Kir6.1loxp/loxpCD11bCre/+小鼠损伤更为明显。结论：1)Kir6.1敲减加剧MPTP引起的小鼠中脑胶质细胞的活化和神经损伤；2)星形胶质细胞Kir6.1敲除对MPTP引起的小鼠中脑胶质细胞活化和神经损伤无显著性影响；3)小胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥重要作用。第二部分Kir6.1/K-ATP通道对小胶质细胞表型的调节作用目 的：应用Kir6.1 siRNA或者pcDNA3.1(-)-Kir6.1转染BV2细胞,观察干扰Kir6.1表达对LPS联用IFN-γ引起的小胶质细胞向M1表型转化和IL-4引起的小胶质细胞向M2表型转化的影响。方法：应用Kir6.1 siRNA或者pcDNA3.1(-)-Kir6.1转染BV2小胶质细胞,WB方法检测转染效率。转染Kir6.1 siRNA或者pcDNA3.1(-)-Kir6.124h后,给予LPS (100ng/ml)与IFN-γ (20ng/ml)刺激,应用RT-PCR方法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA水平变化；应用ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-1 β和IL-6蛋白水平变化；应用CD16/32细胞免疫荧光方法和CCR7流式分析术观察干扰BV2内Kir6.1表达对LPS联用IFN-γ引起的小胶质细胞向M1表型转化的影响；应用WB方法检测MAPK信号、NF-κB信号的变化和Stat1磷酸化水平的变化。转染Kir6.1 siRNA或者pcDNA3.1(-)-Kir6.1 24 h后,给予IL-4(20 ng/m1)刺激,应用RT-PCR方法检测细胞因子Arg-1、CD-206和YM-1mRNA水平变化；应用ELISA检测细胞因子TGF-β和IL-10蛋白水平变化；应用CD206细胞免疫荧光方法和MGL1/2流式分析术观察干扰BV2内Kir6.1对IL-4引起的小胶质细胞向M2表型转化的影响；应用WB方法检测Jakl和Stat6磷酸化水平的变化。结果： 1)LPS联用IFN-y引起小胶质细胞TNF-α、IL-1p和iNOS等炎症因子mRNA水平和蛋白水平的增加,Kir6.1表达下调加剧炎症因子水平的增加, Kir6.1过表达则减轻炎症因子水平的增加；2)Kir6.1表达下调加剧LPS联用IFN-y引起的CD16/32阳性小胶质细胞或者CCR7阳性小胶质细胞数目的增加,Kir6.1过表达则降低M1表型小胶质细胞数目的增加；3)IL-4引起小胶质细胞Arg-1、CD-206和YM-1 mRNA等细胞因子mRNA水平和TGF-β、IL-10蛋白水平的增加,Kir6.1表达下调抑制抗炎因子水平的增加,Kir6.1过表达则促进营养因子水平的增加；4)Kir6.1表达下调促进LPS与IFN-γ刺激引起的p38磷酸化水平的增加,对LPS联用IFN-γ引起的JNK、ERK磷酸化水平的增加无显著性影响；Kir6.1过表达则抑制p38磷酸化水平的增加,对JNK、ERK磷酸化水平的增加无显著性影响；5)Kir6.1表达下调加剧LPS联用IFN-γy引起的IKK、p65磷酸化水平的增加,Kir6.1过表达则抑制NF-κB信号通路的活化；6)Kir6.1表达下调促进LPS联用IFN-y引起的Stat1磷酸化水平的增加,Kir6.1过表达则抑制Stat1磷酸化水平的增加；7)Kir6.1表达下调抑制IL-4刺激引起的Jak1、Stat6磷酸化水平的增加,Kir6.1过表达则促进Jak-Stat信号通路的活化。结论：1)Kir6.1/K-ATP通道促进小胶质细胞由M1表型向M2转化。2)Kir6.1/K-ATP通道调控p38MAPK、NF-κB、Jak-Stat等信号通路参与小胶质细胞表型转化。第三部分Kir6.1/K-ATP通道调节小胶质细胞表型在PD神经损伤中的作用及其机制目 的：应用p38抑制剂SB203580,观察其对BV2表型转化和LPS所致Kir6.1+／-小鼠PD模型神经损伤和胶质细胞活化的影响,阐明Kir6.1/K-ATP通道调控小胶质细胞表型参与PD发生发展的机制。方法：BV2细胞转染Kir6.1siRNA 24h,预孵育SB203580 (10μM)1 h,给予LPS(100ng/ml)与IFN-γ (20ng/ml)刺激,应用RT-PCR方法检测细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA水平变化；应用ELISA检测细胞因子TNF-α和IL-6蛋白水平变化；应用CD16/32细胞免疫荧光方法观察SB203580对小胶质细胞向M1表型转化的影响；应用western blotting方法检测NF-κB信号通路的变化。转染Kir6.1 siRNA 24 h,预孵育SB203580(10μM)1 h,给予LPS(100 ng/m1)与IFN-γ (20ng/ml)刺激24 h,收集上清,刺激SHSY5Y神经元细胞,hoechst染色观察神经元凋亡情况；应用WB方法检测Bax、Bcl-2、caspase3等凋亡相关蛋白变化。应用3月龄Kir6.1+/+和Kir6.1+/-雄性小鼠,中脑黑质部位立体定位注射LPS (5.0 mg)建立PD炎症模型,自模型制备第一日起,连续7日腹腔注射SB203580 (5 mg/kg)。应用WB方法分析Kir6.1敲减对LPS引起的小鼠中脑p38 MAPK信号通路、NF-κB信号通路、IL-1β和CD206蛋白水平变化的影响：应用免疫组织化学染色法结合体视学计数观察SB203580对Kir6.1+/-小鼠中脑SNpc区小胶质细胞增殖活化和DA神经元损伤的影响。结果：1)SB203580可以降低Kir6.1 siRNA组LPS联用IFN-γ引起的NF-κB信号通路的活化；降低小胶质细胞TNF-α、IL-1β等炎症因子mRNA水平和蛋白水平的增加；降低CD16/32阳性小胶质细胞数目的增加；2)SB203580可以降低LPS联用IFN-γ状态下Kir6.1 siRNA组条件培养基所致SHSY5Y神经元的凋亡；3)Kir6.1敲减加剧LPS引起的小鼠中脑p38磷酸化水平的增加、NF-κB信号通路(IKK、p65)的活化、IL-1β蛋白水平的增加和CD206蛋白水平的降低；4)LPS引起小鼠中脑小胶质细胞增殖活化和TH神经元丢失；Kir6.1+/-小鼠中脑小胶质细胞的增殖活化和TH神经元的丢失更为显著；5)SB203580可以减轻LPS引起的Kir6.1+/-小鼠中脑小胶质细胞的增殖活化和TH神经元的丢失。结论：1)Kir6.1敲减加剧LPS引起的小胶质细胞向M1表型的转化,加重神经元损伤；2)SB203580缓解Kir6.1表达下调所加剧的小胶质细胞向M1表型的转化,发挥神经保护作用；3)Kir6.1/K-ATP通道通过p38 MAPK信号通路调控小胶质细胞表型转化参与PD发生发展。综上所述,本文工作的主要创新之处在于：1.揭示小胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥重要作用。Kir6.1基因敲减加重MPTP或LPS所致小胶质细胞的活化,加剧PD模型小鼠中脑神经损伤：星形胶质细胞Kir6.1敲除对MPTP所致小鼠中脑神经损伤和胶质细胞活化无显著影响；小胶质细胞Kir6.1敲除加剧MPTP所致小鼠中脑神经损伤。结果表明,小胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道是参与PD发生发展的重要靶点,拓展了Kir6.1/K-ATP通道在帕金森疾病中的研究。2.发现Kir6.1/K-ATP通道调控小胶质细胞表型转化。Kir6.1基因敲减加剧MPTP或者LPS引起的小鼠中脑小胶质细胞由M2表型向M1表型的转化,加重小鼠中脑神经损伤。BV2细胞内Kir6.1表达下调加剧小胶质细胞向M1表型转化,抑制小胶质细胞向M2表型转化。结果提示,Kir6.1/K-ATP通道是调节小胶质细胞表型转化的重要靶点,为研发靶向于小胶质细胞功能调节的神经保护剂提供了新的靶标。3.阐明Kir6.1/K-ATP通道调节小胶质细胞表型参与PD发生发展的分子机制。p38抑制剂SB203580减轻Kir6.1表达下调加剧的小胶质细胞向M1表型的转化,发挥神经保护作用；SB203580缓解LPS所致PD模型小鼠小胶质细胞活化和DA神经元损伤。本研究从整体、细胞和分子水平阐明了Kir6.1/K-ATP通道通过p38 MAPK信号通路调控小胶质细胞表型转化,为靶向于小胶质细胞功能调节药物应用于PD等神经系统疾病的临床治疗提供基础理论依据。