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香蕉束顶病是香蕉生产上的严重病害,其病原是香蕉束顶病毒(BBTV)。此病毒基因组至少由6个大小约为1.0～1.1kb的单链环状DNA组分所组成,每一个DNA组分包含编码区与非编码区。国内外研究表明DNA组分非编码区具有的启动子功能。本实验是在前人的研究基础上进一步了解BBTV DNA组分启动子的功能。首先根据BBTV海南分离物的全序列,通过PCR扩增出长为540bp的BBTV DNA3组分启动子序列BV3.1,并对序列进行分析,发现有TATA-box、I-box、G-box、G/CC/GTATG序列,CCA(N)_nTGG序列、与韧皮部特异性表达相关的类保守序列等元件。以BV3.1替代pBI121 35S启动子序列与gus基因进行融合,构建植物表达载体pBIBV3.1。农杆菌介导转化获得的pBIBV3.1转基因烟草经GUS化学组织染色后,在其叶片的叶脉处检测到微弱的GUS活性,可以说GUS在烟草转化体中为组织特异性表达。 为进一步研究DNA2组分基本启动区上游序列的启动子功能,通过重叠PCR扩增出DNA2与DNA3组分非编码区拼接的重组启动子序列BV23,长为646bp。通过序列分析,发现有TATA-box、G-box、I-box、G/CC/GTATG序列、类似as-1序列、CCA(N)_nTGG序列等元件。以BV23替代pBI121 35S启动子序列与gus基因融合,构建植物表达载体pBIBV23。通过农杆菌介导转化获得pBIBV23转基因烟草,其叶片经GUS组织化学染色后,主要在叶缘及一些叶脉上检测到弱GUS活性。这表明由BV23驱动的gus基因在烟草中类似于组成型表达。同时并对pBIBV3.1、pBIBV23烟草转化体提取液进行GUS比色法定量分析,其结果表明:BV3.1驱动的gus表达最弱,35S启动子活性是BV3.1的8～12倍;而35S启动子活性是BV23的3～4倍。 由BSV引起的香蕉条斑病是香蕉的主要病毒病之一,其危害仅次于花叶心腐病与束顶病。但BSV基因组可整合到香蕉染色体上其危害又具有潜在性。另外BSV基因组核酸序列在不同分离物间变化很大,且国内对BSV研究甚少,对此进行BSV提纯及其基因组序列克隆是有必要的。本实验取自云南红河地区具有香蕉条斑病典型症状的香蕉叶片,通过超速离心进行香蕉条斑病毒(BSV)的提纯,提取液经负染后,在电镜下观察到23±2nm×110±10nm杆状病毒粒子。并对病毒提取液进行SDS-PAGE电泳分析,在胶上出现至少3条清晰的蛋白条带,这说明BSV可能存在有多种结构蛋白。根据已报道的BSV基因组序列设计引物,通过PCR扩增出BSV ORFⅢ中长为673bp的序列。通过GenBank进行序列比较,发现BSV云南分离物与越南