研究背景和目的急性胰腺炎是临床常见的急腹症之一,近年来发病率逐年增高。根据《2012版急性胰腺炎定义的国际共识》分级标准,其中大多数是轻度,但同时有约15-20%的病例是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),死亡率高达10-30%。重症急性胰腺炎时,大量的炎性细胞激活,多种炎性介质释放,出现全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),导致组织细胞受损,血管内皮屏障通透性增高,进而发生多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)。急性胰腺炎相关肺损伤(acute pancreatitis associated lung injury,APALI)是SAP早期常见的严重并发症,在SIRS引起的炎性反应和氧化应激的直接作用下,肺组织出现细胞坏死、出血,正常肺泡的组织结构被破坏,肺泡腔内液体渗出,换气功能受损,严重的可出现急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),直接导致患者死亡。在SAP后期,APALI还可能进一步演变成肺间质纤维化,严重影响患者的预后和生活质量。有关APALI的治疗方法,目前临床上主要采用控制液体出入量和呼吸机辅助呼吸等手段,但效果并不理想。因此,寻找对APALI行之有效的预防和治疗措施成为SAP临床治疗中亟需解决的问题。胰腺炎相关性腹水(pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF)是急性胰腺炎患者常见的局部并发症,研究表明,早期积聚在腹腔内的PAAF中含有大量的胰酶、炎性介质等毒性物质,可导致腹腔炎性细胞进一步激活,加重SIRS。因此,在急性胰腺炎发病过程中,PAAF可能是毒性物质的“储藏室”,通过腹水重吸收,毒性物质向循环中大量释放。近年来研究表明,腹腔内聚集的腹水可能通过多种机制加重急性胰腺炎病情,例如:(1)PAAF刺激腹腔巨噬细胞进一步产生炎性介质,通过腹膜再吸收进入循环;(2)PAAF中含有的脂肪酶使腹腔脂肪发生分解,导致具有促炎作用的游离脂肪酸等物质在局部和全身循环中增加;(3)PAAF中的红细胞发生溶血,大量游离血红蛋白重吸收入血,加重全身炎症反应;(4)腹腔内积聚的液体过多可造成腹腔内压力增高,并有造成腹腔间隔室综合征(abdominal compartment syndrome,ACS)的风险,损害腹腔脏器。同时,实验研究结果还表明,如果将一定量的PAAF注射至轻型胰腺炎动物的腹腔内,可以造成轻型胰腺炎重型化,明显加重肺组织等器官的损伤程度。然而,既往在临床上PAAF被部分学者认为是可以自行吸收的无菌性积液,对疾病预后没有明显的作用,主张采用待其缓慢自行吸收的保守治疗方法,是否需要积极穿刺引流治疗尚存在争议。此外,目前的国内外急性胰腺炎治疗指南也未专门提及针对PAAF的指导性处理措施,因此急需开展对PAAF在胰腺炎发生发展中的地位及其治疗措施的相关研究。基于这些研究和临床实践,近年来我们尝试在重症急性胰腺炎早期将腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage,APD)应用于临床,对腹腔积液≥100ml且有安全穿刺路径的患者进行积极的B超引导下腹腔穿刺引流。我们的回顾性研究发现,APD可以显著降低急性胰腺炎患者的死亡率,减少血清中胰酶、TNF-α、IL-6等炎性因子的浓度,减少患者器官衰竭率,缩短疾病恢复时间,特别是可以减少APALI患者的气管插管率、呼吸机平均使用时间和肺炎发生率,且不会增加各种感染的机率(Liu WH,et al.Crit Care Med,2015;Liu L,et al.J Clin Gastroenterol,2015)。然而,目前有关APD对胰腺炎相关肺损伤的具体保护作用及其机制尚不明确。可见,澄清其机制能为临床上进一步应用APD提供重要的理论依据。APD可以使血清中的炎性因子浓度降低,直接减少肺组织炎性反应,进而对APALI具有治疗作用。同时,急性胰腺炎发生时,肺组织作为富氧器官,病理状态下极易产生大量氧自由基,后者造成的氧化应激也是肺组织损伤的重要原因之一,但APD对APALI中氧自由基水平的影响尚不清楚。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是体内氧自由基的重要来源,XOD在催化次黄嘌呤的过程中可产生大量单电子,并通过利用氧分子做为电子受体,加速活性氧自由基生成。除了脂质过氧化等直接破坏,氧自由基还可能通过多种途径对肺组织产生间接损伤,例如,白细胞的浸润是肺损伤的标志性事件,白细胞与血管内皮细胞的黏附是白细胞从血管内向组织浸润的重要步骤,这一过程依赖于包括P-选择素在内的多种分子介导,而活性氧自由基可以促进P-选择素的表达上调,从而促进白细胞迁移。因此,通过减少XOD的来源从而降低氧自由基的产生,降低P-选择素表达,是减少肺组织白细胞浸润,治疗APALI的有效措施之一。基于此,我们推测APD可以通过减少肺部氧自由基的产生,降低P-选择素的表达水平而对肺组织起到保护作用。如果我们的假设成立,APD又是通过怎样的途径来降低循环中和肺组织内XOD的活性从而减少氧自由基的产生呢?这一问题的阐明,对于帮助我们理解APD的作用机制,具有重要的意义。在生理情况下,XOD主要以黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase,XDH)的形式大量存在于消化道的血管内皮细胞表面。急性胰腺炎时,大量的XDH从内皮细胞表面解离入血,在胰蛋白酶等作用下转化成XOD。业已证实XDH主要是以糖肽链与内皮细胞相连,具有解离糖肽链作用的α-淀粉酶(α-amylase)极可能在XDH的解离中发挥重要的作用。而含有大量α-amylase的PAAF,在重吸收的过程中会造成肠道周围循环中α-amylase浓度的二次升高,进一步促进XDH从肠道内皮细胞的解离。那么早期通过APD去除PAAF,是否可以减少肠道周围循环中二次升高的α-amylase对XDH的解离和转化作用,从而对肺组织等多个器官起到保护呢?为了阐明上述问题,我们首先制备重症急性胰腺炎大鼠模型并对其进行APD治疗,研究APD对胰腺炎相关肺损伤严重程度的影响。然后,通过将离心后的PAAF上清液逆行注射到轻型胰腺炎大鼠腹腔内,观察PAAF中α-amylase对肠道内皮细胞XDH解离的作用和对肺组织XOD活性的影响。检测通过APD去除SAP大鼠的PAAF后,XDH从肠道内皮细胞上解离和向XOD转化水平的变化,探讨APD对肺组织XDH和XOD活性的影响。最后观察APD对肺组织内氧化应激和P-选择素表达水平以及白细胞浸润程度的影响,探讨APD通过降低氧化应激水平对APALI的治疗作用及其相关分子机制。方法及结果第一部分:腹腔穿刺引流(APD)对重症急性胰腺炎(SAP)相关肺损伤的保护作用研究目的:观察APD对SAP大鼠总体治疗效果和肺组织的保护作用研究方法:1.APD对SAP大鼠死亡率的影响为观察APD对SAP大鼠死亡率的影响,选用42只SD雄性大鼠,随机分入3组(每组14只),分别为:(1)假手术组(Sham group);(2)重症急性胰腺炎组(SAP group);(3)重症急性胰腺炎引流组(SAP+APD group)。采用从胰胆管位于十二指肠壁内的开口逆行向胰腺内注射5%牛磺胆酸钠的方法,制作SAP大鼠模型。造模成功后,常规方法消毒、关腹,通过皮下注射一定量生理盐水补液。假手术组大鼠在开腹后仅翻动胰腺组织后即关腹。APD引流组大鼠在SAP大鼠造模结束后,于右下腹放入“十字花”型引流管,腹腔内引流管长约0.5cm,外接负压引流球,然后消毒关腹。观察记录术后12小时大鼠的情况,并记录死亡率。12小时后处死存活大鼠,收集所有腹水,计量腹水量。2.APD对SAP相关肺损伤的保护作用36只SD雄性大鼠,分为(1)假手术组(Sham group);(2)重症急性胰腺炎组(SAP group);(3)重症急性胰腺炎引流组(SAP+APD group),各组造模方法同前,术后3小时人性化处死动物,再取血清、腹水和胰腺、肺组织及肺泡灌洗液进行以下实验:血清α-amylase、trypsin活性测定;肺组织大体、显微镜下组织病理变化(HE染色)和病理评分,肺组织干湿重比(称量计算法)计算。结果:1.SAP组大鼠的12 h死亡率为57.1%,平均腹水量为(10.1±1.3 ml);SAP+APD组大鼠的12 h死亡率为14.3%,平均腹水量为(7.0±0.9ml),均显著低于SAP组。2.SAP组大鼠血清α-amylase、trypsin比Sham组的大鼠血清含量明显升高;SAP+APD组的大鼠血清α-amylase、trypsin活性较SAP组大鼠血清内α-amylase、trypsin活性明显下降。3.三组大鼠的肺组织大体、组织学观察及病理评分情况:SAP组大鼠肺组织在术后3小时可见明显出血、坏死,炎性细胞浸润。与Sham组大鼠相比,肺组织病理损伤评分明显增高,干湿比例增高;SAP+APD组大鼠肺组织病理评分和干湿重比较SAP组大鼠的肺组织病理评分和干湿重比明显下降。小结:以上结果说明APD对SAP大鼠具有明显的治疗效果,可减少循环中胰酶水平,降低大鼠死亡率。APD对胰腺炎相关肺损伤具有保护作用,可以减少细胞坏死、出血水平,降低肺组织水肿程度。第二部分:XDH/XOD在APD保护SAP相关肺损伤中的作用研究目的:观察APD对肺组织XDH/XOD活性和氧自由基水平变化的影响研究方法:1.APD对肺组织内XDH和XOD活性及氧自由基水平的影响36只SD雄性大鼠,分为(1)假手术组(Sham group);(2)重症急性胰腺炎组(SAP group);(3)重症急性胰腺炎引流组(SAP+APD group),各组造模方法同前。术后3小时人性化处死大鼠,取肺组织,检测:肺组织XOD及XDH活性(ELISA),并测定肺组织SOD活性及MDA水平(分光光度法)。2.PAAF中α-amylase对肠道XDH解离和转化水平的影响24只SD雄性大鼠,采用腹腔注射蛙皮素的方法制作轻型胰腺炎模型后,随机分为三组(每组8只):(1)对照组(Controls);(2)PAAF腹腔注射组(PI);(3)PAAF+α-amylase抑制剂注射组(DPI)。术后3小时人性化处死大鼠,取回肠末端、血清,进行以下检测:肠道内皮细胞XDH及XOD活性(免疫组化和ELISA)测定,血清XDH及XOD活性(ELISA)测定。3.APD对肠道内皮细胞XDH解离和转化水平的影响36只SD雄性大鼠,分为(1)假手术组(Sham group);(2)重症急性胰腺炎组(SAP group);(3)重症急性胰腺炎引流组(SAP+APD group),各组造模方法同前,术后3小时人性化处死大鼠,取回肠末端、血清,进行以下检测:肠道内皮细胞XDH及XOD活性(免疫组化和ELISA)测定,血清XDH及XOD活性(ELISA)测定。小结:1.与Sham组相比,SAP组大鼠肺组织内XDH和XOD活性明显增高,而早期腹腔引流后的SAP+APD组大鼠肺组织内XDH和XOD活性较SAP组的大鼠肺组织内活性明显降低。与Sham组比较,SAP组大鼠肺组织内氧化代谢产物MDA水平升高,氧自由基清除酶SOD的活性下降,经过早期腹腔引流后,SAP+APD组的大鼠较SAP组大鼠肺组织内MDA水平明显降低,SOD活性显著升高。2.腹腔注射PAAF的轻型胰腺炎大鼠与对照组轻型胰腺炎大鼠和注射PAAF+α-amylase抑制剂的轻型胰腺炎大鼠相比,血清内XDH和XOD的活性水平显著增高,肠道血管内皮细胞表面XDH的活性明显降低,XOD的活性稍有升高。3.免疫组化和Elisa检测结果发现,SAP组大鼠肠道血管内皮细胞表面XDH的活性水平较Sham组大鼠活性水平明显下降,XOD活性水平较sham组大鼠活性水平稍有升高,血清内XDH及XOD的活性水平较sham组大鼠血清明显上升。经过腹腔引流后,SAP+APD组大鼠肠道内皮细胞表面XDH活性水平较SAP组大鼠肠道内皮细胞活性水平升高,XOD稍有降低,血清内XDH和XOD活性水平较SAP组大鼠明显下降。小结:APD通过减少腹水的重吸收,抑制α-amylase对肠道内皮细胞表面XDH解离的促进作用,降低循环中XDH向XOD的转化,从而减少肺组织XOD活性和氧自由基水平。第三部分:P-选择素在APD保护SAP相关肺损伤中的作用研究目的:探讨APD通过降低P-选择素表达水平对胰腺炎相关肺损伤的保护作用研究方法:共使用36只SD雄性大鼠,随机分为(1)假手术组(Sham group);(2)重症急性胰腺炎组(SAP group);(3)重症急性胰腺炎引流组(SAP+APD group)。各组造模方法同前,术后3小时人性化处死大鼠,取肺组织进行以下检测:肺组织内P-选择素表达水平变化(real-time PCR及western blot)测定,肺组织MPO(ELISA法)活性测定,计数肺泡灌洗液内中性粒细胞数量。结果:1.与sham组相比,SAP组大鼠肺组织内P-选择素表达水平显著增高,早期腹腔引流后的SAP+APD大鼠肺组织内P-选择素较未治疗的SAP组大鼠表达水平明显降低。2.SAP组的大鼠肺泡灌洗液内中性粒细胞数量以及肺组织的MPO活性,较Sham组大鼠肺泡灌洗液内中性粒细胞数量和肺组织内MPO活性明显增高。而SAP+APD组大鼠肺泡灌洗液内中性粒细胞数量以及肺组织的MPO活性,较SAP组明显降低。小结:APD可以降低重症急性胰腺炎肺组织内氧化应激产物水平,降低肺组织内的P-选择素表达水平,从而减少肺组织内白细胞浸润程度。全文总结1.肺组织血管内皮细胞表面的P-选择素在白细胞的黏附、迁移中起到了重要的作用,而XOD来源的氧自由基可以上调血管内皮细胞P-选择素的表达水平。重症急性胰腺炎时,活性增高的XOD通过上调P-选择素表达促进白细胞向肺组织内的迁移,加重肺损伤严重程度。采用将PAAF通过腹腔注射给轻型胰腺炎大鼠的方法,可以观察到轻型胰腺炎大鼠肠道内皮细胞表面的XDH的解离和转化增加,循环中及肺组织内的XDH和XOD活性明显增高,而α-amylase抑制剂可以拮抗这种现象,说明PAAF内的α-amylase通过腹膜等途径重吸收后,可以促进肠道内皮细胞表面的XDH解离和转化,明显增加循环中XDH和XOD活性,加重肺损伤。2.腹腔穿刺引流通过早期去除PAAF,抑制了重症急性胰腺炎大鼠肠道内皮细胞表面XDH的进一步解离和向XOD的转化,减少了血清和肺组织内XDH和XOD活性和氧自由基的产生,从而降低肺组织P-选择素的表达,最终减少肺组织内白细胞的浸润,减轻肺组织病理损伤(图1)。