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核受体(nuclear receptor)是与类固醇激素受体同源的一类配体依赖性转录因子超家族；机体的生长发育、细胞分化以及体内许多生理、代谢过程都可归因于核受体与相应配体及众多辅调节因子相互作用所调控的基因网络的协调表达。人核受体hB1F(human B1 binding factor)是中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所在研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因的转录调控中克隆到的一个肝脏富集的转录因子，它能够特异结合HBV增强子Ⅱ(enhancerⅡ，ENⅡ)的B1区段并激活ENⅡ的功能。氨基酸序列分析发现，hB1F是核受体超家族Ftz-F1(fush tarazu factor Ⅰ)亚家族的新成员，为一孤儿受体，根据1999年提出的命名原则被正式命名为NR5A2。 对hB1F(NR5A2)以及其他生物中的同源基因的功能研究发现，它对多种肝脏特异基因如α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)和α1-抗胰蛋白酶(alphal-antitrypsin)基因的表达具有重要的调控作用；此外，NR5A2还参与调控肝富集转录因子基因hnfl α、hnf3 β和hnf4 α的表达。近年的实验则表明，NR5A2可激活胆汁酸生物合成途径中两个重要酶即胆固醇7-α羟化酶(cholesterol 7-αhydroxylase,CYP7A1)和甾醇12-α羟化酶(sterol 12-α hydroxylase,CYP8B1)基因表达，因而在生物体的胆固醇代谢平衡调节中发挥重要作用。鉴于NR5A2基因敲除小鼠为早期胚胎致死，提示该基因可能在生物体的早期发育中也具有极其重要的作用。为进一步深入研究NR5A2的生理功能，本研究通过原核显微注射法构建nr5a2转基因小鼠。 论文第一部分，将含人hb1fcDNA的质粒pcDNA3-hb1f显微注射入653颗小鼠受精卵的雄原核并回输至24只假孕受体母鼠输卵管，其中13只怀孕并产下97只仔鼠(雌性45，雄性52)。经PCR法鉴定，共获得11只阳性候选Founder鼠，PCR阳性率为11.3％。进一步对PCR阳性的小鼠基因组DNA作Southern blot杂交鉴定，其中7只呈阳性，阳性率为7.2％。以PCR和Southern blot双阳性的hb1f转基因小鼠为Founder鼠，分别将其与正常C57小鼠杂交以建立转基因小鼠品系(命名为TGM-1、TGM-2、TGM-3、TGM-4、TGM-5、TGM-6和TGM-7)。F1和F2代的PCR鉴定结果表明，7个Founder鼠的转基因都可稳定遗传给后代；第二军医大学博士学位论文中文摘要遗传学专业其中品系TGM一1的4只FZ(2乙2早)经测交实验证实为转基因纯合子，己完成建系任务。同时，经RT一PCR和Western blot分析，发现除TGM一2外其余6个hbZ厂转基因小鼠品系的肝脏都有NRSAZ的表达:对TGM一1的转基因多组织表达分析表明，在cMV启动子驱动下，hblf转基因可在肝脏、心、肺、胃和肾等部位表达。 论文第二部分，为了解外源转基因的表达是否会造成转基因小鼠各重要脏器的器质性改变，TGM一1的主要组织器官经10%甲醛固定后进行常规病理分析。所有送检组织均未见有明显的病理性改变，推测可能外源基因的过表达通过未知的机制抑制了内源同源基因的表达而起了保护性作用。作为一转录因子，本研究感兴趣的更在于hBIF在活体内能调控哪些下游基因的表达。通过基因芯片技术对TGM一1与正常C57小鼠肝脏基因表达谱的比较分析，我们共鉴定到28个差异表达基因，部分基因的差异表达经RT-PCR实验证实。其中包括与胆固醇生物合成相关的焦磷酸法呢酷合成酶基因等25个基因为下调，而皮质类固醇结合球蛋白(又名丝/苏氨酸蛋白酶抑制子)基因等3基因的表达表现为上调。 最后，由于NRSAZ在人肝组织有高表达，为在小鼠体内模拟这一现象，并避免外源转基因在肝外组织表达对结果分析带来的干扰，我们将hblfcDNA置于小鼠白蛋白启动子/增强子序列下游构建肝特异表达的pAlb一hblf载体;再通过原核显微注射将线性化的该载体导入631颗小鼠受精卵并回输至25只假孕母鼠输卵管以构建hblf肝特异表达转基因小鼠模型。18只怀孕母鼠共产下114只仔鼠，经PCR鉴定获得4只携有pAlb一hbjf转基因的候选Founder鼠，阳性率3 .5%;其中一只同时也为southem blot阳性，阳性率0.88%。考虑可能是二者敏感性差别造成检出率不一，所有4只均已作为候选Founder用于转基因小鼠品系的建立 (命名TGM.AI、TGM.AZ、TGM~A3和TGM.A4)。 本论文已完成人核受体NRSAZ基因nr勿2(hb功的广谱和肝特异表达两个转基因小鼠模型建立，该模型的获得为在整体水平进一步深入揭示NRSAZ的生理功能奠定了基础。此外，对n心a2转基因小鼠的初步分析提示，NRSAZ可能通过直接或间接但目前尚未知的机制下调焦磷酸法呢酷合成酶基因的表达，从而在胆固醇代谢平衡等过程中起调控作用。