目的:根据Genebank收录的流行性乙型脑炎病毒序列使用Oligo6.0软件及NCBI Blast设计特异性引物序列;不断优化PCR检测条件,采用不同反应温度,不同反应时间,不同引物浓度确定最佳PCR检测条件,建立流行性乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法。方法:以2013年6月至2013年10月间来本院就诊的21例流行性乙型脑炎患者为研究对象,并且以此期间在本院进行体检的健康人20例为健康对照组,收集所有患者和健康对照组研究对象的血液样本。采用PCR进行检测,并与ELISA方法进行比较。首先从研究对象的血液中分离流行性乙型脑炎病毒,接种BHK-21乳仓鼠肾细胞进行扩大培养,收集增殖培养后的病毒,根据Genebank收录的流行性乙型脑炎病毒序列使用Oligo6.0软件及NCBI Blast设计特异性引物序列,同时不断优化PCR检测条件,采用不同反应温度,不同反应时间,不同引物浓度确定最佳PCR检测条件。对2013年6月至2014年12月间来本院就诊的87例疑似流行性乙型脑炎患者用RT--PCR方法进行检测,检测时直接使用疑似流行性乙型脑炎患者的血清进行检测。并与流行性乙型脑炎脑脊液ELISA检测方法进行比较。检测其准确度和灵敏度。结果:PCR条件为50℃、60min,引物加入1μl时PCR反应效果最佳。结果显示,PCR检测结果阳性率为95.2%,PCR产物测序表明PCR检测准确率达到100%。临床应用测评显示PCR检测的准确率可以达到96.8%。结论:RT-PCR具有很高的诊断准确率,能够缩短诊断时间,降低诊断费用,减少患者受到的伤害,可以在临床诊断乙型脑炎方面推广应用。