研究背景急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由各种非心源性因素引起的进行性加重的呼吸困难、顽固性低氧血症和肺水肿,病理特征是肺泡-毛细血管屏障损伤、通透性增加,通气/血流比例失调致呼吸衰竭,演变为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),在ALI/ARDS中,脂多糖(Lipopolysac charide, LPS)对微血管内皮的直接损伤作用和间接作用都起重要作用,是多种炎症细胞和细胞因子参与,大量多形核中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润激活,释放大量炎性细胞因子。尽管目前已在ALI/ARDS改善症状、控制病死率等药物研究方面有诸多进展,但死亡率仍高达40-60%,因此,寻找新的有效治疗策略,促进ALI/ARDS损伤的修复仍是亟待解决的课题。除引起ALI外LPS可诱发内毒素血症,造成感染性休克、多器官损害及功能衰竭,而心脏是内毒素血症时最常受累器官之一,但内毒素血症心肌损伤及心功能不全的机制并不十分清楚。炎症与细胞凋亡为感染性休克的重要特征,在所有感染性休克发生过程中,大约有40%的患者往往伴有不同程度的心功能不全。虽然细菌可被免疫系统或有效的抗生素杀灭,但休克状态并不一定能得到有效的改善。LPS释放入血后,可诱导巨噬细胞、树突状细胞释放TNF-α、IL-1β等炎性因子,并诱发细胞凋亡。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是潜在多能的一类细胞,缺乏特定的细胞标记系它们的体内特征。MSCs或MSCs样细胞可源于骨髓、脂肪、脐带血、胎盘组织、肌腱和骨骼肌,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)有旁分泌、免疫调节和多向分化的特征,在免疫性疾病治疗、创伤后的修复以及组织的再生等过程中有积极的作用,BM-MSCs具有调节免疫、抑制细胞凋亡、对抗炎症等作用,既往文献报道可通过减轻内毒素诱发的ALI来改善肺功能。BM-MSCs移植治疗心肌梗死大鼠模型的实验,能显著减低动物模型死亡率、缩小梗死面积且心功能恢复更好。然而,较BM-MSCs相比,脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs)更有易提取、细胞量大、增殖率高等优点。血管生成素(Angiopoietin, Ang)是一组分泌型内皮细胞特异性生长因子,在血管生成、胚胎发育及创伤修复等起重要作用,Ang1表达于不同细胞,包括血管周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、巨核细胞等,可减轻炎症反应、抑制细胞凋亡及降低血管通透性,维持肺泡毛细血管膜稳定而在ALI中发挥作用,Ang1修饰BM-MSCs后可与MSCs发挥协同作用,在抗炎及稳定血管内膜、减轻血管渗漏方面发挥了更强的作用。但目前尚无应用Ang1基因修饰的人UC-MSCs治疗ALI的相关报道。且有关于人UC-MSCs-Angl干预LPS诱发的心肌损伤及心功能影响的研究,目前尚未有报道。因此,本研究以UC-MSCs作为载体,利用基因转染技术使其携带并高表达Ang1基因,增强UC-MSCs的作用。应用UC-MSCs-Ang1植入大鼠ALI模型后,观察UC-MSCs与UC-MSCs-Ang对ALI大鼠的抗炎修复作用、减轻肺水肿及炎性细胞浸润、促进干细胞在肺组织的存活,提高ALI大鼠的存活率；研究UC-MSCs-Ang1抑制LPS诱导的心肌损伤炎症反应与心肌细胞凋亡、改善心肌损伤后心脏结构与功能的影响,为脓毒血症急性心肺损伤的细胞及基因治疗提供新的理论依据。研究目的1.人UC-MSCs分离、培养与鉴定；构建携带GFP和Ang1基因的慢病毒载体后转染UC-MSCs,并检测Ang1在转染UC-MSCs中的表达情况。2.建立UC-MSCs-Ang1治疗LPS诱导的大鼠ALI实验方法；观察Angl基因转染后促进UC-MSCs对LPS所致肺损伤、肺水肿、全身炎症反应、细胞植入率、生存率等的改善作用。3.观察UC-MSCs-Ang1抑制LPS诱导的心肌损伤炎症反应与心肌细胞凋亡；研究UC-MSCs-Ang1对LPS诱导心肌损伤后心脏结构与功能的影响,为其在心血管疾病中的应用提供理论依据。研究方法一、人脐带间充质干细胞的生物学特性及Ang1基因修饰UC-MSCs的获得1. UC-MSCs的分离、培养、扩增无菌条件下将脐带组织块采用贴壁法培养原代纤维样细胞,以后传代培养获得纯化的UC-MSCs,5代以后细胞用来后续试验。2. UC-MSCs的形态及免疫表型检测通过倒置显微镜及HE染色观察细胞形态。使用流式细胞仪鉴定CD44、CD45、 CD29、CD31,CD34、CD133、CD90、CD105等细胞表面标识的表达。3. UC-MSCs诱导分化能力的鉴定第5代对数生长的MSCs,在约60%融合时,分别加入成骨诱导培养基、脂肪诱导培养基,2周后进行细胞化学染色鉴定。4.Ang1基因的获取与克隆4.1 Angl引物的设计：在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核苷酸数据库中检索查询人血管生成素1(NM＿001146)全长mRNA序列,设计两端带有BamH1和Sal I酶切位点的引物。4.2 RT-PCR扩增：取正常新鲜人脐带MSCs,采用Trizol方法提取总RNA,以设计的引物进行RT-PCR扩增人Angl cDNA。Trizol法提取肺组织总RNA,RT-PCR技术检测mRNA的表达水平。4.3克隆载体的构建：以T4DNA连接酶将PCR产物与TOPO TA克隆载体连接,将Ang1转入TOPO载体,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑选阳性克隆进行扩增并提取质粒DNA,双酶切及测序验证。5.含有Ang1基因的慢病毒包装、收获及转染效率的测定6.携带GFP和Ang1基因的慢病毒感染UC-MSCs后,荧光显微镜观察荧光表达；转染72小时后流式细胞学检测MSCs中GFP表达、Western-Blot检测MSCs中Ang1蛋白表达。7.统计学分析：所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。二、血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤1.LPS诱导大鼠急性肺损伤模型的建立与分组选择SD大鼠125只,随机分为5组：对照组、LPS组、Fibroblast组、空载MSCs组、MSCs-Ang1组,按照10mg/kg体重腹腔内注射LPS,制造急性肺损伤模型,LPS诱导大鼠ALI之后2h开始体内干预实验,空载MSCs组尾静脉注射含5×105空载MSCs的生理盐水0.3ml, Fibroblast组尾静脉注射含5×105人成纤维细胞(MRC-5细胞系)的生理盐水0.3ml, MSCs-Angl组尾静脉注射含5×105MSCs-Angl的生理盐水0.3ml其余两组注射等量生理盐水。2.分别于造模后6h、24h、48h、8d、5d每组处死3-5只大鼠,收集血清、肺组织,进行常规病理切片、支气管肺泡灌洗液等标本。3.检测肺组织湿干重比、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞计数及肺组织髓过氧化物酶活性的检测、HE染色观察肺组织的病理改变及肺损伤严重程度病理评分。4. ELISA法检测血清中TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-10的蛋白含量。5.MSCs-Ang1在损伤肺组织的迁徙和植入的检测荧光显微镜检测GFP+细胞评估肺组织中外源性MSCs-Ang1细胞在肺组织的分布及植入率。RT-PCR检测GFP mRNA表达评价外源性MSCs-Ang1细胞在肺组织的植入情况。6.生存分析5组健康SD大鼠(每组10只)用于生存实验,计算生存率并绘制生存曲线。7.统计学分析所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。三、血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞改善脂多糖诱导的大鼠左室心肌重塑与功能1.心电图在造模后6h、24h、48h、8d、15d描记肢体导联(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)心电图,观察各组大鼠心脏电活动情况并记录。2.超声心动图分别在不同时间点,行心脏超声测定：左室收缩末内径(LVIDs)、左室舒张末内径(LVIDd)、左室短轴缩短率(FS)以及射血分数(LVEF)。3. Millar导管检测心功能参数处死大鼠之前,麻醉后,于左心尖部用注射器10ml的针头,插入Milllar导管电极,获得心血管相关参数,左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP),左室内压最大上升速率(+dp/dt)、左室内压最大下降速率(-dp/dt),导出数据、分析资料。4.血清学指标检测分别在不同时间点处死大鼠后收集血清,ELISA方法测血清学cTnI、 NT-proBNP.5.病理学检测心肌处死动物后取心肌组织石蜡包埋切片常规HE染色,及透射电镜观察。石蜡切片行免疫组化法检测凋亡细胞百分比数、左室心肌组织TNF-α、IL-6和RIP3的表达。6.实时定量RT-PCR基因水平检测Trizol法提取心肌组织总RNA, RT-PCR技术检测TNF-α、IL-6、RIP3和Caspase-3 mRNA表达水平。RT-PCR检测GFP mRNA表达评价外源性MSCs-Angl细胞在心肌组织的植入情况。7. Western Blot检测提取总蛋白,Western-Blot检测左室心肌组织内炎性因子TNF-α, IL-6,凋亡相关RIP3、Cleaved Caspase-3和Caspase-3蛋白表达。8.统计学分析所用数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。研究结果一、人脐带间充质干细胞的生物学特性及Angl基因修饰UC-MSCs的获得1.培养、鉴定MSCs人类脐带血中,MSCs大量扩增,形态成纤维细胞样,经流式细胞仪,分析表明脐带MSCs可表达CD29、CD90及CD105,不表达CD31、CD45、CD34、CD133；2.诱导分化及鉴定诱导1周后,向脂肪细胞分化的MSCs油红O染色阳性,见有脂滴形成;诱导2周后,ALP染色(+),茜素红染色提示细胞内钙沉积；原本梭形的MSCs呈现变宽平,逐渐分化为成骨细胞。3.慢病毒表达载体的收获及转染效率经酶切将Ang1基因序列经克隆入慢病毒-载体pGC-LV-GV287-GFP,将pGC-LV-GV287-GFP-Angl及两元件pHelper 1.0、pHelper 2.0分别提取、重组质粒,共转染、包装293T细胞,获得pGC-LV-GV287-GFP-Ang1,经超速离心浓缩法后,取到浓缩液。按梯度法稀释后,再荧光滴度法,测滴度2×108TU/ml,接种后加入实验组感染复数为8的pGC-LV-GV287-GFP-Angl,并设pGC-LV-GV287-GFP空载作为对照以鉴定。移去病毒悬液后GFP于第24小时开始表达,细胞内可观察到明显的荧光,转染36h后收集细胞进行Western-Blot检测目的蛋白表达,可以观察到57KD附近处有特征条带。4.收获Angl基因修饰的UC-MSCs以携带GFP报告基因和Ang1基因的慢病毒载体转染MSCs,通过荧光显微镜观察GFP的表达评估转染率,第72小时表达最显著为约95%或更高,通过流式细胞仪检测GFP阳性细胞率97.4%,同时经Western-Blot检测分析Ang1的表达,于转染72小时可见Ang1蛋白显著表达(P<0.05)。二、Angl修饰人UC-MSCs减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤1.ALI后肺组织病理学变化及肺损伤评分腹腔注射LPS 6h后,肺组织病理HE染色表现为明显的毛细血管扩张充血,中性粒细胞明显增多、渗出,并于48h达到高峰,同时出现一些小的脓肿及肺大疱。在LPS注射后的各个时间点,MSCs组和MSCs-Angl组肺损伤评分均降低(P<0.05),其中第24h、48h、8d时MSCs-Angl组的肺损伤评分显著低于MSCs组(P<0.05)。Fibroblast注射组没有改善病理形态学和肺损伤评分。2.支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量及肺组织MPO活性于24h和48h MSCs-Angl组与MSCs组相比,支气管肺泡灌洗液中性粒细胞的数量显著减少(P<0.01-0.05),在第8d、15d MSCs-Angl组的中性粒细胞数接近正常对照组。同时,造模24h之后,MSCs-Angl组与MSCs相比MPO活性均明显降低(P<0.05)。3.肺组织湿干重比LPS组肺组织湿干重比升高(P<0.05),在ALI造模48h、8d, MSCs-Angl组与MSCs相比肺组织湿干比明显降低(P<0.01-0.05)。4. ELLISA检测细胞因子促炎介质TNF-α、IL-6、TGF-β1的血清浓度的升高,证实了LPS造成了显著的急性全身性炎症反应。MSCs-Angl的植入减轻了这些炎症因子的升高(P<0.01-0.05)。 LPS同样引起各时间段抗炎因子IL-10血浆浓度的升高,在24h、48h与MSCs组相比,MSCs-Ang1组IL-10浓度显著升高(P<0.01-0.05)5. MSCs-Angl在损伤肺组织的迁徙和植入的检测荧光显微镜观察移植后第8d, GFP+细胞在MSCs-Ang1组肺组织切片中阳性率大于MSCs组。此外,肺损伤严重的区域GFP+细胞的数量高于损伤轻的区域(P<0.05)。经RT-PCR检测ALI后第8d MSCs-Angl组表达GFP mRNA高于空载MSCs组(P<0.05),LPS组及Fibroblast组几乎没有GFP mRNA表达。实验证实转染的外源性Ang1促进MSCs的植入和存活。6.生存分析MSCs-Ang1治疗组15d生存率明显高于单纯MSCs组,分别为70%和50%(P<0.05)。三、Angl修饰人脐带间充质干细胞改善脂多糖诱导的大鼠左室心肌重塑1.心电图LPS组部分心电图异常表现,可见QRS波形电交替、心动过速、心动过缓等各种复杂心律失常；MSCs与MSCs-Angl干预后,未见明显复杂心律失常减少,提示MSCs-Ang1可部分改善心电活动。2.超声心动图左心结构的改变左心腔室大小,实验初,各组之间LVIDs及LVIDd均无显著性差异(P>0.05)；实验15d,LPS组与对照组比较,LVIDd均扩大(P<0.05)；与LPS组比较,MSCs与MSCs-Ang1干预组LVIDd均减小,MSCs-Ang1干预组减小(P<0.05)；左心收缩功能改变实验初,各组大鼠间FS和LVEF的变化均无显著差异(P>0.05)。实验15d,LPS组与对照组比较,FS、LVEF均不同程度降低(P<0.01-0.05)；与LPS组比较,MSCs与MSCs-Angl干预组FS、LVEF均不同程度升高,MSCs-Angl干预组明显改善(P<0.01-0.05)。3. Millar导管测左心功能实验末,与对照组比较,LPS组LVSP明显下降(P<0.01)、LVEDP升高(P<0.01)、±dp/dt max绝对值降低(P<0.01-0.05),48h-8d小时均明显；与LPS组比较,MSCs与MSCs-Angl干预后的两组,LVSP在MSCs-Angel干预后升高明显(P<0.05),+dp/dt max (mmHg/s)均升高(P<0.05)。与LPS组比较,两干预组LVEDP均不同程度下降(P<0.01-0.05),-dp/dt max (mmHg/s)绝对值升高(P<0.05)。提示MSCs-Angl干预后对左室收缩功能显著改善。4.血清学指标检测与对照组比较,24h时LPS组cTnI水平开始上升并有差异,48h时cTnI水平达到高峰,48h-8d持续升高,提示心肌损伤较重,但MSCs与MSCs-Ang1干预后较LPS组有显著差异(P<0.05),8d时cTnI水平较前减低,15d时明显减低,心肌损伤明显好转。NT-proBNP水平,与对照组比较,24h时LPS组NT-proBNP水平开始上升并有差异,48h时NT-proBNP水平达到高峰,48h-8d持续升高,提示心肌损伤较重的同时,心脏功能明显降低,但MSCs与MSCs-Angl干预后较LPS组有显著差异(P<0.05),8d-15d虽然有降低趋势,但仍持续升高,提示虽然心肌损伤好转,但是心脏功能减低持续时间较长,且心功能不易短期较快恢复。5.LPS诱导大鼠左室重塑心肌炎症、细胞凋亡及MSCs-Angl移植的影响5.1 LPS诱导后大鼠心肌炎症反应及MSCs-Angl移植的影响HE染色：LPS组与正常对照组比较,可见灶性间质水肿,心肌纤维断裂、杂乱排序,间质血管淤血,局部粒细胞增多；与LPS组比较,MSCs与MSCs-Angl干预后的两组,病理情况有所改善。MSCs-Angl移植影响LPS诱导大鼠心肌炎性因子TNF-α、IL-6的表达免疫组织化学检测TNF-α、IL-6的表达：对照组,心肌细胞内少量、稀疏浅棕颗粒;LPS组胞浆见较多深棕颗粒,MSCs与MSCs-Angl干预后的两组与LPS组相比,见棕色颗粒分布呈现散在且稀、疏,减少。Western-Blot检测TNF-α、IL-6蛋白的表达：LPS组TNF-αΟIL-6表达明显增高(P<0.01)。经MSCs与MSCs-Ang1干预后,与LPS组比较,可见心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达呈不同程度的下降(P<0.05)。5.2 LPS诱导大鼠心肌组织细胞凋亡及MSCs-Ang1移植的影响电镜观察凋亡细胞：LPS组显示线粒体排列紊乱,明显增多、肿胀,部分线粒体溶解、嵴断裂,部分肌丝断裂；MSCs与MSCs-Ang1干预后,与LPS组相比,各种病变均有所减轻,MSCs-Ang1干预较MSCs更明显改善。TUNEL染色观察：较对照组,LPS组左室凋亡细胞阳性率显著增加(P<0.01)。MSCs与MSCs-Angl干预后与LPS组相比,细胞凋亡率明显减少(P<0.01)。MSCs-Angl移植抑制心肌细胞凋亡相关RIP3、Caspase-3表达(1)凋亡相关RIP3表达免疫组化染色：较对照组,LPS组RIP3棕黄色阳性颗粒表达增加,且分布在细胞核周围较多,MSCs与MSCs-Ang1两组与LPS组比较,细胞内棕黄色阳性颗粒表达减少,且MSCs-Ang1注射后,棕黄色颗粒明显减少。Western-Blot检测RIP3蛋白表达：较对照组,LPS组表达显著增高(P<0.01)；但MSCs与MSCs-Angl干预后,与LPS组比较,RIP3蛋白表达不同水平降低(P<0.01-0.05)。(2)凋亡相关Caspase-3表达Western-Blot检测Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白比值表达：LPS组与对照组比较,比值显著增高(P<0.01)；但MSCs与MSCs-Angl干预后,与LPS组比较,比值不同水平降低(P<0.01-0.05)。6. GFP mRNA表达外源性MSCs-Angl细胞在心肌组织植入情况检测在移植后第48h、8d MSCs-Angl组的GPF mRNA表达显著高于空载MSCs,有统计学意义(P<0.05)；而在早期MSCs-Angl组的GPFmRNA表达也高于空载MSCs但无统计学意义。移植后第24h、48h、8d,3组细胞RT-PCR检测GPFmRNA表达增加(P<0.05),均提示Angl能促进MSCs在损伤后的心肌组织存活与植入。研究结论1.人脐带中可分离培养大量稳定增殖的MSCs,其细胞表型稳定,存在向成骨、脂肪细胞等多向分化能力,利用病毒转染技术,首次将携带GFP报告基因和Ang1基因的慢病毒载体高效的转染人脐带MSCs。2.转染于脐带间充质干细胞的Ang1基因可通过减少中性粒细胞肺部浸润及MPO活性减轻肺水肿等明显改善LPS诱发的肺损伤、减轻LPS引起的全身炎症反应；提高了干细胞向炎性损伤肺组织的迁徙和植入。3.LPS可导致大鼠心肌重塑及左心功能障碍,UC-MSCs-Angl干预后,可抑制损伤心肌组织中炎症因子及凋亡相关基因的表达,不同程度降低血清中cTnI、含量,提示抑制损伤心肌组织的炎症反应与细胞凋亡,显著降低LPS诱导大鼠的LVEDP和-dp/dt max,增加LVEF和+dp/dt max。提示改善左心室功能。