原核砷还原酶的克隆及在真核细胞中的表达分析

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砷还原酶ArsC在原核生物砷脱毒过程中起着重要的作用,但是在真核生物中,目前为止,只有一种来源于酵母细胞的砷还原酶被识别,还没有发现哺乳细胞中的砷还原酶。本研究中,我们培养了哺乳动物HepG2细胞,先构建质粒pEGFP-N1-ArsC和pCI-neo-ArsC,然后将其转染到细胞中用于ArsC的表达检测。在转染24小时后,质粒pEGFP-N1-ArsC的表达和定位通过共聚焦显微镜检测。经过2个月的G418筛选获得稳定转染ArsC的HepG2细胞,质粒稳转后,提取细胞总RNA进行反转录并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测稳转HepG2细胞中ArsC的表达量。通过MTT实验比较了细胞HepG2-pCI-ArsC和HepG2-pCI在As3+或As5+溶液中的存活率。之后,我们运用化学法-砷钼酸结合显色法检测稳转细胞对五价砷的还原能力。qRT-PCR实验结果发现来源于细菌的砷还原酶ArsC能在HepG2细胞中表达并且在一定浓度砷的诱导下表达量升高。MTT实验发现ArsC提高了HepG2细胞在As5+溶液的存活率,而在As3+溶液中没有变化。另外通过还原实验分析,三价砷的形成在HepG2-pCI-ArsC细胞中有所上升。这些结果证明了原核砷抗性基因参与了真核细胞砷抗性途径。这将有助我们更好地理解ArsC在砷脱毒途径的功能和作用。
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