论文部分内容阅读
背景:糖尿病是威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病之一,其发病率逐年上升,发展趋势不容乐观。糖尿病肾病是糖尿病的第一大并发症,是糖尿病患者发生心血管疾病和早发死亡的重要危险因素。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）是从乙酰化的组蛋白和非组蛋白上去除乙酰基,从而导致染色质浓缩和转录抑制。在HDACs的成员中组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6,HDAC6）是非常特殊的,它并不定位在细胞核中,而主要存在细胞质中。HDAC6在许多疾病的发生发展中起着关键作用,包括癌症、神经退行性疾病和自身免疫病等。前期研究发现HDAC6在小鼠肾脏中是有表达的,而且在糖尿病小鼠肾脏中的表达与正常组小鼠比是升高的。该文探讨了HDAC6是否参与糖尿病肾病的发生和发展且深入探讨了其分子机制。目的:阐明HDAC6在糖尿病肾病发生发展中的作用和分子机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的分子靶点和实验依据。方法:1.体外实验（1）利用Western Blot和免疫组化检测HDAC6在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达以及体外构建糖尿病肾病细胞模型检测HDAC6的表达水平。（2）采用30 mM的葡萄糖（High Glucose,HG）处理原代培养的系膜细胞（Mesangial cells,MC）24 h,采用交互免疫共沉淀的方法观察HDAC6和Smad7之间是否相互作用形成复合物;使用RNA干扰技术下调HDAC6或用基于PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）技术的HDAC6的小分子降解剂处理MC细胞下调HDAC6,再用30 mM的葡萄糖作用于系膜细胞24 h,Western Blot检测在HG处理MC细胞24 h后HDAC6和Smad7的蛋白表达水平;采用HDAC6的特异性抑制剂ACY1215预处理MC细胞30 min,再与HG共处理24 h,通过免疫共沉淀检测HDAC6的抑制剂ACY1215对Smad7的蛋白表达水平、乙酰化水平和泛素化水平的影响。（3）采用RNA干扰技术下调HDAC6,再分别用HG/TGF-β1及LPS共处理原代培养的系膜细胞24 h,Western Blot检测TGF-β/Smads信号通路和NF-κB/p65信号通路是否会因为HDAC6的表达下调而受到抑制。（4）采用HDAC6的特异性抑制剂ACY1215分别与HG/TGF-β1及LPS共处理原代培养的系膜细胞24 h,然后进行如下实验:（1）Western Blot检测TGF-β/Smads信号通路和NF-κB/p65信号通路下游信号分子的表达;（2）用高速离心的方法将细胞核和细胞浆进行分离,免疫印迹分别检测细胞核和细胞质中Smad2/3以及NF-κB/p65的蛋白水平,检测ACY1215是否抑制Smad2/3以及NF-κB/p65的核转位;（3）在荧光显微镜下观察ACY1215是否抑制NF-κB/p65从胞浆转位至胞核;（4）EMSA实验检测ACY1215是否抑制NF-κB/p65作为转录因子与靶基因启动子区的结合。（5）采用HDAC6的PROTAC分别与HG/TGF-β1及LPS共处理原代培养的系膜细胞,Western Blot检测HDAC6的PROTAC是否抑制TGF-β/Smads信号通路和NF-κB/p65信号通路激活。2.体内实验高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）腹腔注射建立糖尿病动物模型,然后灌胃糖尿病小鼠HDAC6抑制剂ACY1215,H＆E、Masson、PAS染色观察糖尿病小鼠肾脏病理改变;免疫组织化学染色观察纤连蛋白（Fibronectitn,FN）的表达;蛋白免疫印迹法检测肾组织中HDAC6、Smad7、FN、Collagen IV、p-Smad2/3和p-NF-κB/p65蛋白的表达情况。结果:1.Western Blot结果表明HDAC6的表达水平无论是在糖尿病肾病细胞模型还是动物模型中都比正常对照组明显升高（P＜0.05）;免疫组化也表明糖尿病组HDAC6表达水平与正常对照组比明显升高（P＜0.05）。2.免疫共沉淀实验结果表明HDAC6和Smad7之间形成了复合物,说明HDAC6和Smad7之间存在蛋白-蛋白相互作用;Smad7是TGF-β/Smads信号通路的负调控因子,Western Blot结果表明,HDAC6的PROTAC和si RNA下调HDAC6的表达后,Smad7的表达增加（P＜0.05）;免疫共沉淀结果表明,ACY1215使Smad7的乙酰化水平增加,泛素化水平降低。3.HDAC6的小干扰RNA可以抑制HG诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制TGF-β1诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制LPS诱导的NF-κB/p65的磷酸化（P＜0.05）。4.HDAC6的特异性抑制剂ACY1215可以抑制HG诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制TGF-β1诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制LPS诱导的NF-κB/p65的磷酸化（P＜0.05）;核浆分离结果表明ACY1215能够抑制Smad2/3以及NF-κB/p65从细胞浆转位至细胞核;免疫荧光结果表明ACY1215能够抑制LPS诱导的NF-κB/p65核易位;EMSA实验结果表明ACY1215能够抑制转录因子NF-κB/p65与靶基因启动子之间的结合。5.HDAC6的PROTAC可以抑制HG诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制TGF-β1诱导的Smad2/3的磷酸化和胞外基质蛋白FN、Collagen IV表达上调（P＜0.05）;抑制LPS诱导的NF-κB/p65的磷酸化（P＜0.05）;免疫荧光结果表明HDAC6的PROTAC能够抑制LPS诱导的NF-κB/p65核易位;EMSA实验结果表明HDAC6的PROTAC能够抑制转录因子NF-κB/p65与靶基因启动子之间的结合。MTT结果表明,HDAC6的PROTAC在10 n M-10μM浓度范围内对MC细胞的活力无明显的影响。6.体内实验观察HDAC6的抑制剂ACY1215对糖尿病肾病的影响。肾脏病理结果显示,对照组小鼠肾小球结构完整,肾小管结构清晰。糖尿病组小鼠存在系膜外基质增多,而药物干预治疗后对上述病理改变有改善作用;免疫组化结果表明,ACY1215能够抑制糖尿病小鼠肾组织中FN的表达（P＜0.05）;Western Blot结果显示与对照组相比,糖尿病组HDAC6、FN、Collagen IV、p-Smad2/3、p-NF-κB/p65蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,而给予ACY1215治疗后,与糖尿病组相比,HDAC6、FN、Collagen IV、p-Smad2/3、p-NF-κB/p65的蛋白表达呈降低趋势（P＜0.05）;糖尿病组Smad7的蛋白表达水平与正常对照组比显著降低（P＜0.05）,而给予ACY1215治疗后,Smad7的蛋白表达呈回升趋势（P＜0.05）。结论:本研究表明,HDAC6在糖尿病肾病动物模型和细胞模型中的表达均升高,HDAC6参与了糖尿病肾病的发生发展;抑制HDAC6的活性或者下调HDAC6的表达可以通过调节Smad7的稳定性调控TGF-β/Smads信号通路和NF-κB/p65信号通路发挥抗糖尿病肾病的作用。