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目的:1.筛选鉴定肝细胞癌转移相关的RNA结合蛋白,检测其在肝癌中的表达水平及与肝癌预后的关系。2.探究RNA结合蛋白RPS7对肝癌细胞迁移、侵袭和转移等生物学行为的影响。3.解析RPS7促进肝癌侵袭转移的分子机制。4.探究LOXL2在RPS7促进肝癌进展过程中的作用。方法:1.通过RNA-seq分析肝癌伴肝外转移（转移组）和肝癌不伴肝外转移（非转移组）中癌组织与癌旁组织比较后差异表达的RNA结合蛋白基因;GO数据库分析候选基因;TCGA数据库联合KM生存曲线进一步分析候选基因。2.q RT-PCR、Western blot法分别检测RPS7在60例肝细胞癌临床样本中的mRNA和蛋白表达水平,IHC检测RPS7在肝癌组织中的表达和定位。3.构建RPS7敲减/敲除的肝癌细胞模型,利用此细胞模型,采用CCK-8和集落形成实验检测细胞的增殖能力;细胞外基质粘附实验检测细胞对I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白和纤连蛋白这些外基质成分的粘附能力;划痕实验和Transwell实验评估细胞的迁移侵袭能力。利用RPS7稳定敲除的细胞,分别在原位肝癌肺转移小鼠模型和尾静脉肺转移小鼠模型中评估RPS7基因敲除对肝癌细胞肺转移的影响。4.构建RPS7稳定高表达的肝癌细胞系,利用此细胞模型,方法同前,检测细胞的增殖能力,粘附外基质的能力以及迁移侵袭能力。5.利用RPS7基因敲减的细胞进行RNA-seq分析,筛选差异表达的下游基因;利用KEGG数据库联合cat RAPID数据库筛选出与RPS7有潜在结合作用的基因;KEGG数据库分析候选基因。q RT-PCR筛选下调基因通路中表达差异显著的候选基因。6.q RT-PCR、Western blot检测RPS7基因敲减或高表达后对下游靶基因LOXL2表达水平的影响。7.双荧光素酶报告系统评估RPS7对LOXL2启动子活性的影响;利用新生RNA捕获实验评估RPS7对LOXL2新生RNA水平的影响;RNA decay实验检测RPS7对LOXL2 mRNA稳定性的影响。8.RIP实验验证RPS7与LOXL2 mRNA的结合;RNA pull-down实验联合截短突变技术进一步明确RPS7与LOXL2 mRNA的具体结合区域。9.q RT-PCR检测LOXL2在60例肝癌组织及癌旁组织中mRNA的表达水平,Western blot检测人肝癌细胞系中LOXL2的表达水平。10.靶向LOXL2的小干扰RNA处理MHCC97H细胞48 h,检测细胞对外基质的粘附能力和细胞的迁移侵袭能力的变化。11.携带LOXL2的质粒转染Huh7细胞48 h后,检测细胞对外基质的粘附能力和细胞的迁移侵袭能力的变化。12.RPS7基因敲减的MHCC97H细胞中高表达LOXL2 48 h后,检测细胞对外基质的粘附能力和细胞的迁移侵袭能力的变化。13.靶向LOXL2的小干扰RNA转染RPS7高表达的Huh7细胞48h后,检测细胞对外基质的粘附能力和细胞的迁移侵袭能力的变化。14.利用Spearman相关性分析法分析TCGA数据库以及60例肝癌临床样本中RPS7和LOXL2的表达水平的相关性。结果:1.筛选出102个与肝癌转移密切相关的候选RNA结合蛋白基因,通过GO分析在粘附斑功能模块中筛选出7个候选基因;TCGA数据库联合KM生存分析发现RPS7和NPM1与肝癌预后有关。进一步利用TCGA数据库分析发现相较于NPM1,RPS7在肿瘤中的差异表达具有肝脏特异性。2.q RT-PCR、Western blot和IHC检测发现RPS7在肝癌组织的mRNA和蛋白表达水平均显著高于癌旁,且转移组中RPS7的表达水平明显高于非转移组。高表达的RPS7与肝癌预后不良呈正相关。3.RPS7基因敲减/敲除细胞的增殖能力,细胞对外基质的粘附能力以及细胞的迁移侵袭能力均明显低于对照组。体内实验结果显示RPS7基因敲除的MHCC97H细胞构建的小鼠模型中,小鼠原位肝脏肿瘤结节的大小和数目,以及肺转移病灶数均少于对照组。4.RPS7高表达细胞的增殖能力,细胞对外基质的粘附能力以及细胞的迁移侵袭能力均明显高于对照组。5.RNA-seq数据筛选出基因敲减RPS7后差异表达的下游基因,KEGG分析发现下调表达基因主要富集在与侵袭转移相关的信号通路中。6.q RT-PCR检测发现下调表达基因中差异显著的前12个候选基因中,LOXL2的mRNA水平随着RPS7的表达下调而显著下调。Western blot也发现LOXL2的蛋白水平也受RPS7调控。7.双荧光素酶报告结果显示RPS7敲减或高表达均对LOXL2的启动子活性无影响;新生RNA捕获实验发现RPS7对LOXL2新生RNA的水平无影响;RNA decay实验发现RPS7基因敲减后LOXL2的mRNA半衰期缩短,而RPS7高表达则延长了LOXL2的mRNA半衰期。8.RIP实验证实RPS7与LOXL2 mRNA之间存在结合关系。RNA pull-down联合截短突变技术发现LOXL2 mRNA 3’UTR区3190-3259序列范围内连续的两个AUUUA基序是LOXL2 mRNA与RPS7的主要结合位点。9.q RT-PCR检测发现LOXL2在60例肝癌组织中的mRNA水平高于癌旁,且转移组癌组织中LOXL2的mRNA水平高于非转移组。10.靶向LOXL2的小干扰RNA处理MHCC97H细胞48 h后,细胞对外基质的粘附能力和细胞迁移侵袭能力均显著低于对照组。11.LOXL2高表达质粒转染Huh7细胞48 h后,细胞对外基质的粘附能力和细胞迁移侵袭能力均显著高于对照组。12.RPS7基因敲减的MHCC97H细胞中,LOXL2高表达可部分逆转RPS7基因敲降导致的粘附外基质能力以及迁移侵袭能力的降低。13.RPS7高表达的Huh7细胞中,LOXL2基因沉默可削弱RPS7高表达导致的粘附外基质能力以及迁移侵袭能力的增强。14.TCGA数据库和60例肝癌样本的结果均显示人肝癌组织中RPS7和LOXL2的mRNA水平存在显著的正相关关系。结论:本研究发现RNA结合蛋白RPS7在肝癌组织中普遍高表达,且在转移组中的表达水平显著高于非转移组;同时,预后生存分析显示,RPS7高表达与HCC患者不良预后密切相关。进一步探究发现RPS7沉默可抑制肝癌细胞的粘附、迁移侵袭和肺转移;高表达时则相反。机制研究表明,RPS7通过与LOXL2 3’UTR区3190-3259序列范围内两个连续的AUUUA基序结合,增加LOXL2 mRNA稳定性进而上调LOXL2表达;LOXL2作为RPS7的重要下游靶基因,密切参与了RPS7介导的肝癌细胞的粘附、迁移和侵袭。综上,本研究发现RPS7通过增加LOXL2 mRNA稳定性促进肝癌转移侵袭。