目的:幽门螺杆菌是一种革兰阴性的螺旋杆菌,普遍存在于人类的胃黏膜。它在人类胃部长期的定植可以导致不同的临床疾病,如:慢性胃炎、胃溃疡,甚至胃癌。其高效定植需要的先决条件在于幽门螺杆菌的高度进化与适应性。高度的遗传多态性与高效的随机重组是幽门螺杆菌两大特征,这种特征表现为每个感染患者的幽门螺杆菌几乎都有独特的基因组大小、基因顺序、遗传信息以及等位基因谱。此外,同一株菌的不同变异体可能生存于同一宿主的胃内,互相作为一个潜在的基因型储备,一旦宿主体内出现新的选择压力,最具适应性的基因型将在新平衡中成为优势菌群,保证了菌株的长期定植。研究发现,幽门螺杆菌的微进化可能导致宿主体内菌株的基因型发生变异以及胃内优势菌群发生变化,不仅可能与耐药和复发有关,还可能影响胃上皮细胞相关的信号转导和代谢通路,以此影响疾病的进程。对宿主体内感染菌株的基因多态性和变异性进行研究分析,确定其变异规律和致病机制,也能有针对性地解决幽门螺杆菌感染治疗中易出现的复发和耐药难题。目前,国外对幽门螺杆菌的基因多态性进行了较为广泛的研究,并运用多种方法检测单个宿主幽门螺杆菌的基因型多态性,但研究结果尤其是多态性百分比报道不一,由10%至67%不等。而国内针对宿主体内幽门螺杆菌基因多态性与致病性的研究还是空白。中国地区有着独特的生活习惯和饮食文化,中国地区患者体内的幽门螺杆菌基因多态性必将呈现其独有的特征。同时,本实验室前期培养过程中发现,一些临床株的原代培养单菌落在传代后不能生长,我们据此猜测传代过程中可能会存在基因型的丢失。要真实地反映宿主体内幽门螺杆菌基因组多态性,必须对过往研究方法进行改良。因此,本实验以幽门螺杆菌原代单菌落为研究对象,通过随机扩增多态性DNA(RAPD)的方法检测患者体内幽门螺杆菌的基因组多态性。并通过患者体内幽门螺杆菌原代培养和传代培养RAPD图谱的比较,验证传代过程中基因型丢失的假设,进一步证实宿主体内基因组多态性的广泛性。在明确宿主体内幽门螺杆菌基因组多态性的基础上,为了分析并初步探索这种多态性现象的形成机制,本实验还将应用多位点序列分型(MLST)的方法探寻这种宿主体内的基因多态性现象的变异来源。此外,作为一级致癌因子(grade I carcinogen),幽门螺杆菌在致癌过程中所起的重要作用一直非常受到关注。sabA基因作为幽门螺杆菌在定植过程中重要的黏附素,在长期定植以及致癌过程中有可能发挥重要的作用。同时,中国幽门螺杆菌的高感染率和高基因多态性百分比是否与地域和文化之间的差异有关,仍有待研究。因此,本实验还将对毒力因子sabA基因进行遗传信息多态性的研究。方法:1.采用常规方法分离培养2009-2010年间中国杭州和重庆的幽门螺杆菌临床株,并从原代培养平皿上随机挑取18-24个单菌落,提取单菌落基因组DNA,使用属特异性的16S rDNA引物通过聚合酶链反应( PCR)对菌落进行鉴别。选用三个随机引物(1254, 1281和A11)来检测原代菌落并建立原代RAPD图谱。以各菌落的所有扩增条带完全相同为一种基因型,分别比较每个患者的基因型数目以确定其多态性。国际标准株26695的传代菌落作为对照,以鉴定RAPD系统的稳定性。其中随机选取20名患者的原代分离培养物持续培养3代后,挑取18-24个单菌落以同样的方法进行RAPD的检测,并对原代和传代的RAPD图谱进行比较。同时,用Fisher精确检验法检测基因型数目与临床疾病之间的相关性。2.为探寻同一患者不同基因型的变异来源,运用多位点序列分型(MLST)的方法,分别对随机选取的30名患者不同基因型的6个管家基因(atpA, efp, ppa, trpC, ureI and yphC)进行扩增。对扩增的产物进行纯化后测序。序列比较由DNAssist 2.0软件完成。通过各位点序列差异判断其变异来源。3.采用PCR及测序和比较基因组方法分析42株国内癌症及癌前病变患者的幽门螺杆菌sabA基因CT双核苷酸重复序列调节区多态性。采用SPSS 12.0统计软件的Fisher’s精确检验方法对阳性率与疾病的关系进行统计分析,采用MEGA 5.0聚类软件的construct UPGMA tree功能聚类分析。结果:1.对116名患者体内分离幽门螺杆菌的RAPD检测结果显示宿主体内的基因多态性非常普遍。在最初用随机引物1254检测的结果中,宿主体内幽门螺杆菌存在多种基因型的比例为83.6%。在使用3种随机引物检测后,基因多态性百分比达到99.1%,仅在一名胃炎患者中发现存在单一基因型。同一宿主内有2-3种基因型在消化不良、胃炎、消化性溃疡的患者占大多数,其比例分别为100%、91.4%和77%。同一宿主内有4种基因型主要出现在消化性溃疡、萎缩性胃炎(癌前病变)和癌症患者中,且比例相当,分别为20%、20%和17%。同一宿主内有5种基因型只在消化性溃疡、萎缩性胃炎(癌前病变)和癌症患者中发现,其比例分别为3%、20%和33%,呈梯度上升。临床疾病分类与基因型数目之间有相关性(P<0.05)。对其中20名患者的幽门螺杆菌传代RAPD图谱和原代图谱的比较分析发现,经体外传代3次后90%患者(18/20)的幽门螺杆菌基因型减少到只有一种,另外2名患者的基因型减小为2种,大部分基因型由于无法适应体外培养环境而丢失。2.对30名患者不同基因型的菌落进行多位点序列分析结果表明,26名患者不同基因型菌落的6个管家基因序列是完全相同的。另外3名患者只有atpA位点DNA序列有部分无义点突变,氨基酸序列没有影响。而另1名严重复合型溃疡患者的其中一种基因型所拥有的yphC位点不仅DNA序列有13个碱基突变,也导致了氨基酸序列的4个氨基酸的改变,其中一个颠换(UAT变成UAG)导致了一个新的终止子产生,提前终止了翻译过程。由于每名患者都至少有5个管家基因序列是完全相同的,可认为宿主体内的基因多态性来自同一菌株的变异。3. sabA基因调节区的阳性检测率为85%,功能性sabA基因占所有测序菌株的55%。对随机挑选的18株检测阳性的菌株进行测序分析,结果显示在碱基水平及蛋白质水平存在显著的遗传多态性。对sabA基因调节区的氨基酸序列聚类分析中发现,本研究的中国菌株与国际已经完成测序的7株幽门螺杆菌可以明显的分为两个组,即中国组与西方组。结论:1.宿主体内幽门螺杆菌基因组多态性现象在中国地区非常普遍;临床疾病分类和患者体内幽门螺杆菌RAPD基因型数目有相关性。原代培养物在传代培养后基因型减少。2.患者体内的基因组多态性主要来源于同一菌株的变异。3. sabA基因CT双核苷酸重复序列调节区在中国菌株中普遍存在,且在翻译水平有很显著的多态性,含有功能性sabA基因的幽门螺杆菌菌株多态性存在明显的地域性分布差异。