【研究背景与目的】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球范围内是第五大常见恶性消化道肿瘤,并且是世界范围内癌症死亡的第三大原因,其发病率和死亡率近年来逐渐上升。目前手术切除和肝移植被公认为是肝细胞癌最好的治疗方法,但由于复发和转移的高发生率,HCC患者的预后仍然无法令人满意。肝癌的血管侵犯被认为是由肿瘤表达的一种具有侵略性的生物学行为,是目前预测肝癌复发的最关键因素之一。MVI(microvascular Invasion,MVI)作为血管侵犯的一种特殊类型,存在于肝癌发展过程中一个特殊的中间阶段,其通过侵犯门静脉或肝静脉分支形成肝内复发或全身转移,从而影响患者预后。然而国际及国内诸多学者对MVI的定义、分级尚存在争议,并且鉴于肝癌MVI在评价组织特性、预后以及治疗方面仍存在很大的异质性,因而目前对于MVI的诊断仍然依赖于术后的病理检测。很多研究者从影像学,病理学,血清学等方面进行大量的研究,发现了很多指标均与MVI的发生相关,但鉴于这些指标在MVI的预测有效率方面还较低,因而限制了临床运用,探索有效的生物标志物提高术前MVI的预测诊断正确率也就成为了目前MVI研究领域的热点。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称,因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶渗入到周围组织脱落到外周血液循环,大部分CTCs会在机体的作用下发生凋亡,少部分能够逃逸免疫系统并发生远处转移。相关研究证实,CTCs存在于恶性肿瘤形成远处转移性病灶的中间过程,与患者的临床预后关系密切相关,可以成为预测肿瘤患者预后的一个较为可靠的辅助因子,甚至有研究者提出将CTCs检测加入到现有的肝癌临床分期指标,进而提高肝脏肿瘤术后转移及复发的预后评估能力。近年来,伴随着生物研究技术的进步,外周血中CTCs的富集、分离、鉴定技术逐渐建立成熟。本实验室通过前期相关研究发现肝癌CTCs检出和CTCs个数与肝脏肿瘤直径大小、是否发生大血管侵犯(门静脉癌栓)、TNM的临床分期等均紧密相关,并且研究表明CTCs影响HCC术后患者的预后。但关于CTCs与血管侵犯的另一特殊类型MVI两者之间是否具有相关性,目前还尚未有相关报道。因此我们就CTCs与MVI之间是否具有相关性展开了进一步深入研究。在本研究我们进一步优化了的肝癌CTCs分离和鉴定技术,在分离方面运用Ficoll密度梯度离心结合磁性激活细胞分选术(Magnetic activated cell separation,MACS)富集肝癌CTCs,通过标记CD45单克隆抗体的免疫磁珠阴性分选去除肝癌患者外血液中的淋巴细胞。阴性分选法与阳性分选法相比降低了肿瘤特异性对富集CTCs的影响。在选取进一步鉴定肝癌CTCs的标志物方面,我们尝试了很多指标,发现有肝癌细胞特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamy phosphate synthetase 1,CPS1)的混合指标在鉴定肝癌CTCs方面特异性及敏感性都较高。经过前期预实验验证,建立多色免疫荧光染色方法后,我们采集HCC患者的外周血液检测术前CTCs,并通过术后病理HE染色确定是否发生MVI,最终结合临床病理资料,探讨CTCs在术前肝癌MVI预测运用中的临床价值,以期为后续进一步研究针对肝癌CTCs及MVI的个体化治疗提供了理论依据。【研究方法】1.建立多色细胞免疫荧光染色技术富集、分离、鉴定、计数肝癌CTCs:采集所有患者5m L外周血(采用含EDTA的5m L抗凝管),通过Ficoll-Paque PLUS分离液进行密度梯度离心后,用磁性标记的抗CD45单克隆抗体提取表达CD45的白细胞来富集肝癌CTCs。用离心涂片机将富集到的细胞分在多聚赖氨酸玻片上制成细胞涂片,人去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1,CPS1)小鼠单克隆抗体和大鼠抗人CD45单克隆抗体的混合物共孵育,再用兔抗小鼠-Alexa Fluor647 Ig G,山羊抗大鼠-Cy3作为二抗孵育,随后用DAPI染色。通过荧光显微镜评估染色的载玻片。ASGPR+CPS1阳性,DAPI阳性,CD45阴性,且符合形态学特征的细胞记为CTCs。采用上述方法检测108例肝癌患者CTCs表达情况,并计数CTCs。2.病理标本HE染色判断肝癌患者MVI发生:根据《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015版)》,将MVI定义为显微镜下可见的微小静脉(中央静脉、门静脉分支或包膜外小静脉)内漂浮有成团癌细胞且周边有明确的血管内皮细胞环绕。对所有患者肿瘤组织固定,切边制作成病理切片,对所有的病理切片进行HE染色,通过显微镜下观察,依据指南鉴别有无MVI发生。3.统计分析CTCs与MVI之间的相关性:收集并统计肝癌患者临床及病理资料,对纳入检测的108例肝癌患者检测、鉴定CTCs并计数。连续变量以平均值加减标准差表示。分类变量表示为频率和百分比,单因素分析方法采用χ2检验,多因素分析用Logistic回归分析,以确定与微血管侵犯发生的独立相关相关因素,并使用ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)检验并比较各因素的临床效能。以双侧检验作为检验标准,P<0.05认为具有统计学意义,所有的统计分析均采用SPSS 18.0软件。【研究结果】1、ASGPR+CPS1/CD45鉴定指标可用于分离、富集、鉴定出样本中的肝癌CTCs,是一种可靠有效的方法,而基于多色免疫荧光染色技术建立的CTCs鉴定方法可以用于准确得判定肝癌CTCs表达。检测结果显示24例肝癌患者中有18例可以检测出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)细胞,检出率为75%。12例其他恶性肿瘤患者(2例食管癌,2例胃癌,4例胆囊癌,3例结肠癌和1例乳腺癌)以及10名健康志愿者的外周血中,未检测出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)细胞。2、肝癌患者术前每5ml血中CTC数目检出平均值36±24个。术后病理证实44例HCC患者为MVI(+),其中男性30例,女性14例;64例患者为MVI(-),其中男性41例,女性23例。CTC(+)患者64例,血清AFP>400μg/L患者49例,肿瘤直径>5cm的44例,肿瘤数目单发的51例,肿瘤多发的57例。基于肝癌患者外周血中是否检测出CTCs将患者分成两组(CTC(+)和CTC(-)组)。患者外周血中CTC(+)与MVI的表达,肿瘤数目,DCP>40m Au/m L及前白蛋白≤170mg/L显著相关,差异有统计学意义,但与其他临床病理特征没有显著相关性。3、MVI(+)患者44例,CTC(+)检出33例,检出率为75%;MVI(-)患者64例,CTC(+)检出18例,检出率28%。患者术前外周血液中的CTC(+)检出率高于MVI(-)患者差异具有统计学意义(P<0.001),MVI(+)阳性患者与MVI(-)阴性患者相比,前者发生CTCs的可能更大。4、将本研究的108例患者的临床病理参数进行单因素回归分析,结果提示:CTC(+),AFP>400μg/L,DCP>40m Au/m L、肿瘤直径和肿瘤数目是MVI发生的独立危险因素。而多因素Logistic回归分析结果提示:CTC(+)、AFP>400μg/L、DCP>40m Au/m L和肿瘤直径是MVI发生的独立危险因素。5、为了评价各因子的预测价值,使用了ROC曲线来分析他们的灵敏性和特异性。CTC(+)的ROC曲线下面积为0.73,灵敏性为75%,特异性为71.9%,并且其ROC曲线下面积明显高于单个因素如:AFP>400μg/L,DCP>40m Au/m L、肿瘤直径。此外,CTC(+)、AFP>400?g/L、DCP>40m Au/m L和肿瘤直径组合后进行多因素分析时生成的ROC曲线下面积为0.86,灵敏性为84.38%,特异性为72.37%。【研究结论】本研究建立的多色免疫荧光染色方法可靠实用,可用于肝癌CTCs术前分离鉴定。HCC患者外周血中检测出CTCs与其MVI的发生密切相关,CTCs能较好的术前预测MVI的发生,并为后续进一步研究针对肝癌CTCs及MVI的个体化治疗提供了理论依据。