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高血压是引发心血管疾病如心力衰竭、中风、冠心病和心肌梗塞等的重要危险因子。血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin I-converting enzyme inhibitors,ACEI)是用于防治高血压的最重要的药物之一,但易引起恶心、呕吐、腹泻等副作用。因此,高效无毒的海洋生物源ACE抑制肽的研制具有巨大的市场空间。我国存在大量鱼类下脚料,这些鱼类下脚料含有丰富的海洋生物源蛋白质,可为ACE抑制肽的开发提供重要原料来源。然而,这些鱼类下脚料主要用来制备低附加值产品,既污染环境,又造成大量资源浪费。
本论文以海洋鱼类下脚料鱼鳞为原料,制备ACE抑制肽,实现海洋生物资源的高值化和产业化,在满足患者需求的同时避免环境污染,真正实现经济、社会和生态效益。
本文以狗母鱼(Trachinocephalus myops(Forster))鱼鳞为原料,采用响应面法优化鱼鳞蛋白多肽的提取工艺和鱼鳞ACE抑制肽的制备工艺;建立食源性ACE抑制肽体外活性的检测方法;利用多级膜分离技术分离纯化鱼鳞蛋白多肽;运用多种检测技术研究鱼鳞ACE抑制肽的理化性质。主要研究结果如下:
1.建立高效液相色谱法(HPLC)测定鱼鳞ACE抑制肽的抑制活性。该方法具有良好的精密度和重复性,在1～200μ g·ml-1浓度范围内,马尿酸的浓度与峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9999),最低检测限为0.5μ g·ml-1,对马尿酸的回收率为99.46～101.19％,相对标准偏差(RSD)为0.55％(n=9)。
2.分析狗母鱼鱼鳞原料的化学成分,确定鱼鳞蛋白质含量为39％,疏水氨基酸占总氨基酸的33.59％,是制备ACE抑制肽优良的蛋白质源。
3.选择10种特异性蛋白酶提取鱼鳞蛋白多肽,以蛋白质提取率作为主要的评价指标,水解度为辅助评价指标,筛选出胃蛋白酶为提取鱼鳞蛋白多肽的特异性蛋白酶。运用响应面法优化鱼鳞蛋白多肽的提取工艺,研究了温度、pH、时间和酶与底物浓度比对鱼鳞蛋白多肽提取效果的影响,确定酶解的最佳工艺条件:酶添加量0.90％、温度51℃、pH值1.1、时间5.1h、料液比1:10,鱼鳞蛋白多肽蛋白质提取率达72.77％。
4.利用陶瓷膜、反渗透膜和电渗析集成的多级膜分离技术分离纯化鱼鳞蛋白肽,鱼鳞蛋白多肽的得率为78.67％。
5.以纯化后的鱼鳞蛋白多肽为原料,以ACE抑制活性为主要的评价指标,水解度为辅助评价标准,筛选出中性蛋白酶为制备ACE抑制肽的特异性蛋白酶。运用响应面法优化鱼鳞ACE抑制肽的制备工艺,研究温度、pH、时间和酶与底物浓度比对鱼鳞ACE抑制肽ACE活性和水解度的影响,确定制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为温度47℃,底物浓度4％,酶与底物浓度比3.2％,pH值7.0,水解时间为170min,制各样品ACE抑制活性IC50值为0.16mg·ml-1。
6.鱼鳞ACE抑制肽的理化性质研究表明样品的蛋白质含量为92.46±0.05％,水分含量为5.46±0.13％,灰分含量为1.98±0.21％,所含疏水性氨基酸占总氨基酸含量的36.85％,相对分子质量集中在2000Da左右,ACE抑制活性IC50值为0.16mg·ml-1,比目前市售日本降压肽活性高(0.39 mg·ml-1)。稳定性实验表明其具有良好的热稳定性及pH稳定性,对消化酶水解具有一定的抗性,经消化酶水解后,ACE抑制活性变化不显著,具有制成口服类保健品的潜力。