在过去的十年里,越来越多的证据显示胶质细胞并不仅仅是为神经元提供支持,调节神经细胞的代谢,调节局部神经递质及离子浓度,进行神经组织损伤的修复及参与免疫反应,同时还参与了各种神经活动过程,包括正常生理过程的完成及疾病发生、发展的病理过程。现已明确,胶质细胞在发热,睡眠异常,学习记忆破坏,以及神经系统炎症和神经退行性疾病,如脑缺血、脑中风、Alzheimer病和Parkinson病等疾病过程中发挥重要作用。新近的研究还证实,胶质细胞参与了疼痛、尤其是慢性痛的产生和维持。在经典的疼痛理论及研究过程中,研究者总是致力于探讨神经元机制并由此设计实验并开展各种观察,包括检测形态结构、物质代谢及各种功能活动等的改变,而胶质细胞常被排除在外。然而一个不争的事实是,疼痛研究在经历了漫长的时期后,虽然已获得大量的研究成果,但痛觉机制尤其是慢性痛的机制仍未明了,导致疼痛治疗缺乏有效手段。随着胶质细胞研究的深入,越来越多的注意力开始转向胶质细胞,即了解胶质细胞在各种神经功能活动异常、包括痛觉产生中的作用,尤其是慢性痛、神经病理痛发生发展中的作用,并已获得一些有意义的结果。研究发现,皮下注射formalin或完全氟氏佐剂(CFA)、外周神经或背根神经节结扎、脊髓组织损伤、以及鞘内注射HIV-1gp120,在引起机械性和热刺激痛敏反应的同时,也引起了脊髓背角小胶质细胞的激活。鞘内给予小胶质细胞代谢抑制剂minocycline,在抑制了小胶质细胞活化的同时,还抑制了痛觉敏感的形成。这些结果明确提示,胶质细胞在各种疼痛模型中发挥了重要作用。与其他类型的细胞相比,小胶质细胞对于外来或异常信号的敏感性更高,可以接受多种刺激信号包括各种伤害性刺激信号而发生反应,并最早进入活化状态。经典的formalin痛模型即脚掌注射formalin,引起持续约1小时的双相性痛行为反应。由于该模型能较好地模拟临床急性炎症痛,并可采用定性或半定量的指标对痛反应进行测量,因而被广泛应用于疼痛机制的研究。但新近的研究显示,formalin皮下注射除引起上述急性炎性痛外,还可以引起持续性的痛敏状态,持续时间远远超过1小时,可一直持续3到4周。在发现这种长时程痛敏反应的同时,还观察到脊髓背角小胶质细胞的激活,持续时间与痛敏反应时程一致。在以往的实验观察中,本研究室及其他研究者的观察都证实,第一组代谢型谷氨酸受体在formalin引起的急性炎性痛中发挥重要作用。本实验的设计目的就是在外周注射formalin的基础上,通过对痛行为观察(热辐射刺激缩足反射潜伏期)、小胶质细胞活化增殖的免疫组化检测(OX-42阳性表达)和对脊髓腰膨大组织匀浆进行磷酸化p38MAPK(P-p38)的western blot检测,结合外周及鞘内注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂CPCCOEt(mGluR1)和MPEP(mGluR5),观察外周和脊髓第一组代谢型谷氨酸受体在formalin所致的长时程痛敏及脊髓小胶质细胞活化过程中可能发挥的作用。研究包括三部分内容:1)观察外周局部注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂对formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化的影响;2)观察脊髓鞘内注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂对formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化的影响;3)利用同样的模型,观察脊髓p38 MAPK信号途径在第一组代谢型谷氨酸受体介导的长时程痛敏和小胶质细胞活化中的作用。第一部分外周第一组代谢型谷氨酸受体在formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞活化中的作用本实验室前期的研究发现,第一组代谢型谷氨酸受体参与了formalin经外周伤害性感受器引起的急性痛行为反应(即持续1小时的双相痛反应)。本部分实验拟观察外周局部给予第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂包括CPCCOEt和MPEP对脚背注射formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞活化的影响。实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行。90只大鼠分为三组,分别在formalin脚背注射前15分钟预先在脚背皮下(便于脚掌进行热辐射痛反应测定)给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或作为对照的HEPES Buffer(100mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、10天、2周、3周和4周进行连续的痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧);另外从各组动物中再随机选出24只在formalin注射后2小时、1天、7天、2周、3周和4周共6个时间点(每个时间点4只)进行痛行为(包括formalin注射侧及对侧)观察,并分别进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测。此后分别对所得数据进行图像分析及统计学处理。行为学观察结果显示,大鼠足背给予formalin(5%,50μl)后,动物即刻出现痛行为反应,表现为PWL(Paw Withdraw Latency)的缩短,2小时即出现了痛敏反应的高峰并持续到在formalin注射后10天,之后恢复正常。在formalin注射后第3周再次出现痛觉敏感,第4周时恢复正常。在外周应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,两个注药组的行为测试数据显示PWL延长,分别与对照组相比,均在formalin注射后2小时、1天、3天具有显著性差异(P＜0.05)。免疫组化结果显示,大鼠足背给予formalin后,脊髓背角小胶质细胞在2小时后表达增加,高峰出现在7天,之后逐渐减弱。在外周应用CPCCOEt(100nmol)MPEP(50nmol)之后,小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低。在2小时、7天OX-42阳性表达与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。实验结果提示:1.formalin外周注射可形成长时程痛敏,持续时间超过2周,与此同时,观察到脊髓背角小胶质细胞的活化增强,提示这可能是导致长时程痛敏的主要原因之一;2.外周局部注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂,可阻断或减弱了formalin导致的长时程痛敏和脊髓背角小胶质细胞的激活,提示这类受体参与了formalin引起的外周痛感受器的激活。第二部分脊髓第一组代谢型谷氨酸受体在formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞活化中的作用本研究第一部分的观察证实,外周局部给予第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以有效抑制外周注射formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。那么第一组代谢型谷氨酸受体是否在脊髓水平也参与了formalin外周注射所引起的长时程痛敏反应和脊髓小胶质细胞的活化呢?本部分实验利用上述的痛模型结合鞘内注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂对此加以证实。实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行,同样进行行为学和免疫组化两项观察。54只大鼠分为三组,分别在formalin注射前15分钟预先鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者注入HEPES Buffer作为对照(100 mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、2周、3周和4周进行连续痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧),另外从各组动物中随机再随机选出12只进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测,但只设formalin注射后2小时、7天和4周共3个时间点(每个时间点4只)进行。此后对所得数据进行图像分析及统计学处理。行为学观察结果显示,对照组动物可出现痛行为反应,表现为PWL的缩短,同样在2小时出现痛敏反应的高峰,并持续到7天。在鞘内分别应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,PWL明显延长;CPCCOEt可以有效抑制formalin注射后2小时、1天、3天和7天的痛敏,而MPEP则只抑制了formalin注射后2小时和1天的PWL缩短。免疫组化结果显示,鞘内应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,formalin注射后2小时和7天的小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。实验结果提示:1.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化;2.在脊髓水平第一组代谢型谷氨酸受体参与了formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。第三部分第一组代谢型谷氨酸受体参与formalin引起的长时程痛敏和小胶质细胞活化过程的机制探讨—p38MAPK途径分析丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它可以介导细胞外刺激信号进入细胞,引发转录和翻译水平的反应。MAPK家族主要包括ERK、p38MAPK、和c-Jun(JNK/SAPK)。p38作为MAPK的家族成员可以调控与细胞损伤(包括炎症因子、热休克、紫外线照射和缺血等)相关的一些病理过程。大量的研究证实,在许多疼痛模型中都有p38MAPK的活化即磷酸化过程,并且磷酸化的p38MAPK主要位于小胶质细胞。这些结果提示,小胶质细胞在参与疼痛的过程可能主要是通过p38MAPK通路发挥作用。本实验在前面二部分实验结果的基础上,观察第一组代谢型谷氨酸受体是否通过p38MAPK信号途径参与长时程痛敏和小胶质细胞的活化。实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行。首先观察formalin外周注射后脊髓p38MAPK的磷酸化过程。在formalin注射前、注射后5分钟、15分钟、60分钟、1天、3天、7天、2周和4周,分别取大鼠腰膨大组织进行匀浆,利用Western blot技术观察磷酸化p38MAPK(P-p38)的表达,用以反映p38MAPK的活化情况。结果显示,如果以基础状态的P-p38水平作为100%,注射formalin后各时间点的P-p38的表达分别为303.78%、182.56%、101.68%、273.84%、101.22%、174.78%、104.08%、108.97%,亦即在formalin注射后5分钟出现了P-p38的表达峰值,随后恢复正常,但又在formalin注射后1天再次出现P-p38的表达增加之后恢复正常。在此基础上,我们又分别观察了外周或鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt或MPEP之后P-p38的表达情况。在formalin注射前15分钟分别在外周或鞘内给予CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者HEPES(100mM,pH7.4)作为对照,之后在formalin注射后5分钟和1天,取出动物腰膨大部位进行Western blot检测。结果发现,在外周或鞘内给予CPCCOEt或MPEP之后,可以抑制formalin注射后5分钟时的P-p38的表达增加。而对于formalin注射后1天的P-p38增加,只有在外周给予CPCCOEt时表现出抑制作用。本实验结果提示:1.formalin外周注射可以引起脊髓p38MAPK的活化,表现为磷酸化的p38MAPK表达增多,提示p38MAPK可能是介导formalin痛反应的主要信号通路;2.外周应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;3.脊髓应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;4.以上结果提示提示第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)通过活化脊髓p38MAPK信号通路在formalin引起的慢性痛中发挥重要作用。据我们掌握的文献,这是首次报道第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)p38MAPK在细胞水平介导其功能反应。结论:1.formalin外周注射可以引起长时程痛敏(持续时间在10天以上),同时伴有脊髓小胶质细胞的活化;2.外周第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;3.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了formalin诱导的长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;4、外周和脊髓的第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)的p38MAPK通路介导上述作用;5、结合我们以往观察到的第一组代谢型谷氨酸受体在formalin急性痛反应中的作用结果提示,第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)在痛信号产生和传递及由此引起的痛反应(包括急性痛反应和慢性持续性痛反应)中发挥重要作用。