论文部分内容阅读
目的:槲皮素(Que)可诱导癌细胞氧化应激反应,检测在氧化应激条件下,对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-231/Syk细胞凋亡的诱导作用及与Syk基因表达之间的相互影响。以STAT3为靶基因,设计并构建能够产生小发卡RNA(shRNA)的重组质粒载体,体外转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-231/Syk细胞并加以Que药物干预。通过体外实验,观察Syk与MDA-MB-231和MDA-MB-231/Syk细胞株STAT3表达之间的相互影响,来探讨其相关信号转导途径,为乳腺癌的基因治疗提供实验和理论依据。方法:1用逆转录-聚合酶链式反应(revers transcription PCR , RT-PCR)、蛋白质印记技术(Western blot)检测MDA-MB-231/Syk细胞Syk的表达。2用RT-PCR分析槲皮素(20μmol/L此浓度与预实验中所计算的IC50接近)处理48小时后MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞STAT3的表达情况;采用免疫细胞化学技术检测pSTAT3在MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中的表达情况。3采用RNAi技术特异性沉默MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3的表达,通过Western blot技术和半定量RT-PCR法检测经RNAi作用后MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞STAT3表达水平的变化;在荧光显微镜下观察细胞转染48h后的形态和荧光数,以判断转染的效率;瑞士-吉姆萨染色观察细胞转染48h后细胞形态学变化。4经RNAi技术特异性沉默MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3的表达后,流式细胞技术分析对细胞凋亡的影响,通过半定量RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因bcl-2和Bax表达的变化。5采用RNAi技术干预MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞,并设空白对照,干预24、48、72 h后,分别用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法分析细胞增殖情况。6通过划痕实验检测RNAi技术特异性沉默MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3 48h后,侵袭和转移能力的改变;用RT-PCR检测RNAi特异性沉默MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3 48h后,对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9 mRNA的影响。7槲皮素( Que )及STAT3 shRNA诱导MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞凋亡的研究。分五个实验组:A组:空白对照组,不采取任何干预措施,实验时于MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中加入无血清的RPMI1640培养基进行培养;B组:阴性对照转染组,用阴性对照质粒转染MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞;C组:RNAi组,用STAT3-1、S-STAT3-1质粒转染MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞;D组:Que处理组,于MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中加入Que,使其终浓度为20μmol/L(此浓度与预实验中所计算的IC50接近);E组: RNAi+Que组,于MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中转染STAT3-1、S-STAT3-1质粒,同时加入Que,使其终浓度为20μmol/L。转染48 h后,MTT法测定不同处理组MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1槲皮素(20μmol/L)可明显抑制MDA-MB-231细胞中STAT3的表达(P<0.05),但槲皮素作用前后,MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3的表达水平无显著性差异(P>0.05)。2 STAT3基因特异性RNAi可有效沉默MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中STAT3的表达(P<0.05)。3 STAT3的表达被RNAi特异性沉默后,细胞凋亡的百分比明显增加,与对照组和阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。bcl-2 mRNA的表达水平受到明显抑制,Bax mRNA的表达升高,与对照组和阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。4瞬时转染RNAi STAT3 24、48和72h后, MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞的增殖均明显受到抑制,48h和72h受抑制明显,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。5 RNAi STAT3特异性沉默48h后,可明显抑制MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞的侵袭和转移能力,可使MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞划痕的直径明显变宽(P<0.05),可明显下调MDA-MB-231及MDA-MB-231/Syk细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表达(P<0.05)。MDA-MB-231/Syk细胞组与MDA-MB-231细胞组相比有显著差异(P<0.05) ,转染Syk基因的MDA-MB-231细胞与未转染的MDA-MB-231细胞相比,侵袭及迁移能力均明显减低(P<0.05) ,MMP-2、MMP-9 mRNA的表达量明显减少(P<0.05)。6 RNAi、Que、RNAi+Que作用不同时间(24h、48h、72h)后,MDA-MB-231细胞的增殖受到不同程度的抑制,抑制率随时间的延长而增强,与空白对照组比较均有显著性升高(P<0.05),阴性转染组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)。RNAi+Que组在不同的作用时间分别与RNAi组、Que组比较有显著性升高(P<0.05)。经过RNAi STAT3处理的MDA-MB-231细胞能够显著地提高Que对MDA-MB-231细胞增殖的抑制程度,提示两者有一定的协同效应。RNAi、RNAi+Que作用不同时间( 24、48、72h )后,MDA-MB-231/Syk细胞的增殖受到不同程度的抑制,抑制率随时间的延长而增强,与空白对照组比较均有显著性升高(P<0.05),阴性转染组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),Que组与RNAi、RNAi+Que组比较均有显著性升高(P<0.05),Que组细胞增殖没有受到明显抑制。7流式细胞术分析结果显示,RNAi、Que、RNAi+Que作用48 h后,MDA-MB-231细胞凋亡率均明显增高(P<0.05),以RNAi+Que处理组凋亡率为最高,由对照组的(4.10±1.51)%升高至(37.29±2.85)%。空白对照组和阴性转染组之间无显著性差异(P>0.05)。流式细胞术分析结果显示,RNAi、RNAi+Que作用48 h后,MDA-MB-231/Syk细胞凋亡率均明显增高(P<0.05),以RNAi+Que处理组凋亡率为最高,由对照组的(5.50±1.56)%升高至(38.35±3.01)%。空白对照组和阴性转染组之间无显著性差异(P>0.05),Que组与RNAi、RNAi+Que组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论:1设计并构建的shRNA表达载体能够通过RNA干扰有效封闭STAT3基因的表达。2针对STAT3的shRNA可以抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭转移,促进乳腺癌细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用。3在氧化应激条件下,Syk可诱导STAT3的激活;槲皮素和STAT3 shRNA技术二者联合体内抗肿瘤作用更为显著。