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在过去的十年里,转基因抗草甘膦作物的广泛应用为现代农业生产创造了显著效益。然而,由于长期大规模使用草甘膦,目前已有32种杂草对其产生抗性,并以每年增加一到两种抗性杂草的速度在增长。因此,迫切需要挖掘抗其它类型除草剂的抗性基因,丰富除草剂类型,以便与草甘膦交替或混合使用,从而控制杂草对草甘膦的抗性发生。 细胞色素P450家族(Cytochrome P450 super family,CYP)是一类广泛存在于动植物及微生物体内的血红素氧化酶系。它们不仅参与激素、脂类及次生物质等的内源代谢,在除草剂的代谢和解毒过程中也发挥了重要的作用。目前,许多与除草剂代谢相关的P450基因已被克隆出来。 狗牙根(Cynodon dactylon)是一种可以高度耐受多种除草剂的杂草,因此其可能拥有抗除草剂的基因。本研究利用RT-PCR和RACE的方法,从狗牙根(Cynodon dactylon)中克隆获得了两个高度同源的细胞色素P450基因N-Z1和N-Z2。为验证其是否具有除草剂抗性,首先采用分子生物学方法分别将N-Z1和N-Z2的表达框插入到包含草甘膦抗性表达框的T-DNA中,获得植物转化载体。利用农杆菌介导法将上述载体转入拟南芥,进行除草剂抗性能力测定。转N-Z1基因拟南芥的除草剂测试结果表明,其不仅耐磺酰脲类除草剂(烟嘧磺隆和五氟磺草胺),对HPPD抑制剂硝磺草酮、激素类除草剂麦草畏、光系统Ⅱ抑制剂莠去津和苯达松均具有较强的耐性。同时,我们还测试了N-Z1对精恶唑禾草灵、乙草胺、苄嘧磺隆、啶嘧磺隆、敌草胺以及2,4-D的抗性,结果表明N-Z1转基因拟南芥对这些除草剂都具有一定的抗性。而转N-Z2基因拟南芥对烟嘧磺隆等上述除草剂都不具有耐性。 为了研究N-Z1在大豆中是否也具有以上除草剂抗性特征,我们构建了大豆N-Z1表达载体,该载体构架类似于上述拟南芥转化载体,但是选用草胺膦作为筛选标记基因,通过农杆菌介导法获得大豆转化株系。耐除草剂试验结果表明,N-Z1转基因大豆植株对乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂烟嘧磺隆和啶嘧磺隆的抗性水平分别达到1280 mg/L、800mg/L,超过了田间杂草防治的使用浓度;对激素类除草剂2,4-D具有较好的抗性,可达到1200 mg/L,接近大田使用浓度;对另一种激素类除草剂麦草畏的抗性水平大致为400-800mg/L。N-Z1转基因大豆对硝磺草酮也具有抗性,当药剂浓度低于100 mg/L时,转基因植株可正常生长,但当浓度超过100mg/L时,开始出现药害。 本研究从狗牙根中挖掘出的N-Z1基因具有代谢不同作用机制的除草剂的功能。该基因的发掘不仅丰富了已有的除草剂抗性基因,为培育新一代抗除草剂转基因作物提供了新选择,对于延缓杂草抗性的发生具有重要的意义。