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目的:Ⅰ型长QT综合症（LQT1）是由KCNQ1基因突变引起缓慢激活延迟整流钾通道电流(IKs)减小,从而影响心肌细胞复极化,心电图表现为QTc间期延长或者室速室颤,表现为头晕、晕厥、恶性心律失常甚至出现心源性猝死等一系列的临床综合症症候群。其中LQT1为遗传性长QT综合症中最常见的一种类型。KCNQ1基因编码的蛋白为Kv7.1通道,是缓慢激活延迟整流钾通道的α亚单位。Kv7.1通道与KCNE1基因编码的β调节亚单位共同构成IKs。目前研究认为KCNQ1基因突变引起LQT1的机制有:显性负效应、单倍剂量不足、通道蛋白转运障碍、通道蛋白磷酸化障碍等。临床研究报道显示KCNQ1基因的孔区区域存在相对较多突变,且和其他区域的突变相比,孔区的突变在临床上伴有更高、更严重的心脏事件发生率。然而其确切致病机制尚不清楚。因此本实验拟对未阐明机制的KCNQ1钾通道孔区10种突变位点导致LQT1的机制进行研究。方法:1.通过定点突变的方法克隆出KCNQ1基因孔区未阐明机制的10种突变位点质粒,并分别与KCNE1基因共同转染CHO细胞,利用全细胞膜片钳检测突变对IKs通道功能的影响。2.利用Western blotting检测突变组与野生型组KCNQ1钾通道蛋白在CHO细胞中的表达。3.构建含Flag和GFP标记的KCNQ1基因质粒:将KCNQ1基因所编码蛋白的胞外第一跨膜与第二跨膜间分别插入1xFlag、3xFlag标签序列,以及在KCNQ1钾通道的C末端、N末端分别融合表达GFP,并分别克隆出质粒,利用全细胞膜片钳检测KCNQ1基因带标签后对IKs通道的影响。4.利用细胞免疫荧光共聚焦（Confocal）、全内反射荧光技术成像（TIRF）进一步检测野生型组与突变体组KCNQ1通道蛋白在CHO细胞膜上的定位和表达。5.人胚胎干细胞诱导分化成为的心肌细胞（hESCsCM）上验证无IKs电流对动作电位的影响:向人胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中加入终浓度为30μmol/L IKs特异性阻断剂色满醇293B,并通过膜片钳的电流钳记录加药前后心肌细胞的动作电位时程（APD）变化。结果:1.表达野生型KCNQ1钾通道和KCNE1β亚单位的CHO细胞能记录到典型的IKs电流;表达孔区突变的KCNQ1钾通道和KCNE1β亚单位的CHO细胞中的10种突变的每一个突变基因所编码的通道都不能记录到IKs电流（n=9,P<0.01）。2.Western blotting结果显示:10种突变位点的KCNQ1基因在CHO细胞中的表达与野生型组间都没有差异。3.KCNQ1基因带标签后的通道功能:全细胞膜片钳检测在CHO细胞中表达N末端融合表达GFP的KCNQ1钾通道,结果显示会严重影响IKs通道功能,而在KCNQ1钾通道的C末端融合表达GFP不会影响IKs通道的功能;另外在KCNQ1钾通道S1-S2的第146位的谷氨酸与147位的谷氨酰胺间插入3xFlag标签序列后IKs电流激活明显增快（P<0.01）,而在相同位置插入1xFlag标签序列则不影响电流的动力特性以及功能。4.细胞免疫荧光共聚焦结果显示突变体组转染CHO细胞带1xFlag标签的KCNQ1质粒能在细胞膜上检测到Flag荧光;野生型组C端融合表达GFP也能在细胞膜上检测到GFP;两组共同转染CHO细胞也都分别能在细胞膜上检测到对应的荧光。TIRF结果显示突变组与野生型组间在细胞膜上Flag所对应的单位面积荧光强度没有差异。5.人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞的IKs电流被阻断后所记录的动作电位明显延长。结论:1.成功构建并鉴定出不影响通道动力学的双标签KCNQ1基因质粒,为直观、定量地检测KCNQ1通道蛋白在细胞膜的表达和细胞内转运提供了重要工具。2.KCNQ1基因孔区突变不影响通道蛋白的生成和转运,而是引起通道开放障碍从而导致IKs功能缺失。3.成功诱导hESCs分化为心肌细胞,并发现人来源的心肌细胞复极化过程中无IKs电流会导致APD明显延长。