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斑茅(Erianthus arundinaceus)是甘蔗的重要近缘属植物,生长势强、抗旱、耐瘠、宿根性好,是甘蔗育种的重要基因资源。本研究在系统分析斑茅抗逆性基础上,通过同源克隆结合RACE技术、Northern杂交、原核表达等,克隆斑茅BADH基因,并研究其在抗逆方面的分子作用。结果如下: 在干旱和盐胁迫条件下,斑茅丙二醛含量增幅较拔地拉小,质膜受损小,抗氧化酶类的清除、防御膜脂过氧化的能力强、脯氨酸积累多,斑茅的抗逆性明显强于拔地拉;利用常规比色法测定拔地拉和斑茅中的甜菜碱含量,表明斑茅甜菜碱含量高达10.73 mg/100g FW,与已测定的15植物甜菜碱含量相比,斑茅的甜菜碱含量仅次于藜科植物碱蓬和盐吸,位居第三,而拔地拉不含有或痕迹量甜菜碱。 用RT-PCR和RACE技术克隆了斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因。斑茅BADH cDNA全长1718bp,5′端290bp左右片段GC含量高达75.9%,包含一个1515 bp的开放读码框,5′端非编码区35bp,3′端非编码区165bp,理论分子量为54.905 kDa,其推演氨基酸含有十肽VTLELGGKSP和一个与酶功能有关的Cys为醛脱氢酶高度保守的序列,以及C-端信号肽SKL。将斑茅BADH编码区1515 bp核苷酸序列在GenBank中进行比较,发现其与Zea mays PCO110216的已知部分序列同源性为97%;与S.bicolor BADH1部分序列同源性为95%;与O.sativa BADH、H.vulgare BBD2和T.aestivum BADH的5′端无同源性。 分子进化分析表明,22个BADH基因由同一基因进化成五个类群,双子叶植物进化变异较大;所有已知禾本科植物斑茅、高粱、玉米、大麦、小麦的BADH基因为一簇,其中按同工酶类型分为两组;斑茅与高粱的同源性高于斑茅与玉米,以及高粱与玉米的同源性。 包含醛保守序列的斑茅BADH部分cDNA序列作探针,进行Southern和Northern杂交分析。结果表明,斑茅BADH在基因组中有一到两个拷贝;斑茅BADH为诱导型表达基因,干旱胁迫,表达量增加,复水后其表达量减少;盐胁迫时,表达量随着胁迫时间增加,然后保持某一水平,但又受环境温度影响;盐胁迫10天时,根中甜菜碱醛脱氢酶的表达量大于茎中的,茎中的大于叶中。 构建斑茅甜菜碱醛脱氢酶的原核表达载体,原核表达斑茅甜菜碱醛脱氢福建农林大学博士学位论文酶基因,在酶粗提液中检测到酶的比活力为9.04Inn。功吐n一,m扩蛋白。 斑茅BADH基因的成功分离并转导甘蔗将有利于实现甘蔗抗早基因工程,提高抗早育种效率。