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卵巢生殖干细胞(Ovarian germinal stem cells,OGSCs)是来自于卵巢皮层的双潜能干细胞,能通过对称分裂产生一个新的干细胞或不对称分裂分化为卵巢生殖细胞和原始颗粒细胞。卵巢生殖干细胞在光镜下呈圆形,约15-20um,数目稀少,经传代增殖后可见成串或成簇存在,经PCR检测表达MVH、OCT4等多种生殖细胞和干细胞标志物。本实验室通过改良上海交通大学吴际教授实验室的方法,已稳定地建立了分离、提纯和培养卵巢雌性生殖干细胞的方法,为雌性生殖干细胞的研究打下了坚实的基础。我们前期的研究证明灌胃壳寡糖可以提升病理性不孕小鼠的免疫功能和生殖功能,但壳寡糖是直接促进卵巢生殖干细胞增殖分化,还是先通过提升小鼠免疫力然后间接促进卵巢生殖干细胞的增殖分化以补充卵泡池尚不清楚;壳寡糖对小鼠生殖干细胞增殖和衰老的作用机制其中具体机制还不清楚。本研究首先改良了小鼠卵巢生殖干细胞的分离和培养的方法,然后检测壳寡糖在细胞水平是直接促进OGSCs的增殖,还是通过增强免疫系统间接促进OGSCs增殖,从而延缓卵巢衰老,重塑卵巢功能。为卵巢早衰和不孕症的防治提供新的思路方法和新的药物互作位点。1 OGSCs分离和培养方法的改良(1)OGSCs分离方法的改良:分析比较了改良两部酶法(改良法)与经典两步酶法(经典法)和免疫磁珠法(磁珠法)分离OGSCs的优缺点。细胞纯度在磁珠法最高,改良法次之,经典法最低;细胞增殖曲线在改良法最好,磁珠法次之,经典法最差。(2)OGSCs培养方法的改良:本实验首次利用巨噬细胞(RAW)代替STO细胞作为滋养层,在用丝裂霉素C处理巨噬细胞时,以10mg/L处理2小时的效果最好,此时巨噬细胞细胞增殖能力基本被抑制且细胞状态最好。以巨噬细胞作为滋养层后卵巢生殖干细胞数量明显增多。(3)分离和培养后的OGSCs的鉴定:经形态学观察小鼠卵巢生殖干细胞呈圆形、核质比高,增殖后呈串珠样排列;免疫荧光双标显示该细胞同时表达生殖系标志物MVH和干细胞标志物OCT4,也同时表达生殖系标志物MVH和增殖标志物EDU;碱性磷酸酶染色阳性;RT-PCR显示表达MVH、OCT4、Fragilis、Dazl、Stella等多种生殖细胞和干细胞标志物。结论:改良两步酶分离法分离出的OGSCs细胞活性好、杂细胞少、细胞增殖良好,为今后OGSCs的相关研究奠定了重要基础;改良OGSCs的培养方法以巨噬细胞作为滋养层,开创了一条对OGSCs研究的新道路。2初步探究壳寡糖对OGSCs增殖和衰老的作用实验分为四组,Control组(1组)、Cos组(2组)探讨是否有直接作用,RAW组(3组)、RAW+Cos组(4组)探讨是否有间接作用。1-4组的数据结果显示,细胞增殖曲线表现为不同程度的增高;碱性磷酸酶(AP)染色结果显示为不同程度的降低;细胞上清液细胞因子检测发现,IL-2、TNF-ɑ表现为不同程度的增高,IL-10、TGF-β表现含Cos的组比相应对照组有不同程度的降低;WB结果显示,免疫因子(IL-2、TNF-ɑ)相关蛋白、卵巢生殖干细胞(MVH、OCT4)相关蛋白、抗衰老基因(SIRT-1、SIRT-3)相关蛋白均表现为不同程度的增高,而免疫因子(IL-10、TGF-β)相关蛋白、衰老基因(P21、P53)相关蛋白表现为不同程度的降低。结论:壳寡糖可能是通过调控巨噬细胞的细胞因子的分泌间接促进OGSCs的增殖和抑制其衰老。