肺癌是当今世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，也是临床治疗疗效最差的恶性肿瘤之一。2012年美国癌症死因统计显示肺癌的死亡率在过去的30年内上升了200％，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率近年来持续上升，2011年卫生部统计结果显示，肺癌位居我国癌症死因的第一位。肺癌的防治是全世界共同面对的一项难题。大约有85％的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)，主要分为两种组织学类型:腺癌和鳞癌。　　 关于肺癌的病理学研究很多，目的是发现新的治疗靶点。近年来有EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)在含有EGFR突变的肺癌中使用，并取得了很好的治疗效果。　　 Mig-6又称做RALT或Errfil最早是在对细胞周期的研究中发现的。Mig-6的表达在许多生理和病理状态下被一些因子如激素、生长因子等强烈诱导。它是EGFR通路的负向调控因子，能够通过负反馈抑制EGFR信号的激活并影响它的稳定性。它在人体分布广泛，与多种肿瘤的发生有密切关系。　　 但是，Mig-6在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系并未见文献报道，Mig-6的变化影响肺癌细胞生物学功能及其作用机制也未有研究。为了明确以上问题，我们检测了NSCLC中Mig-6的表达情况，分析了Mig-6表达与临床病理因素的关系，通过干扰肺癌细胞系H1299和BE1中Mig-6基因的表达，探讨了Mig-6对肺癌细胞侵袭、增殖能力的影响及其相关机制。　　 材料和方法：　　 1、患者及标本　　 这项研究在中国医科大学伦理委员会的批准下进行。来自2008-20101年在中国医科大学附属第一医院手术的病人，组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。这些患者在手术前均未接受放化疗。组织学诊断和分化程度根据WHO分类标准进行判定，按国际抗癌联盟的肺癌P-TNM分期标准.　　 2、免疫组织化学染色　　 将石蜡包埋的肺癌组织块切成4μm厚切片，癌旁的正常支气管上皮作为阴性对照。使用即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus检测试剂盒.结果判定:两位病理医生对切片分别作出判定，每张片子随机选五个高倍镜视野。　　 3、细胞培养　　 肺癌细胞系H1299，A549，H157购自ATCC，BE1来自郑洁教授的惠赠。细胞使用RPMI1640培养基含10％的灭活小牛血清.37℃、5％CO2的条件下培养，每两天换一次液，并用0.25％的胰酶进行传代。　　 4、EGFR突变分析　　 75例石蜡包埋的肺癌标本用于EGFR突变检测，原发肺癌组织均来自2009-2011年在中国医科大学附属第一医院手术的病人.　　 5、小干扰RNA实验　　 转染前24h将细胞按50％密度接种于24孔板，Mig-6的特异性siRNA及阴阳性对照均购自上海吉玛公司，采用DharmaFECT1转染试剂进行转染，转然后48h使用PCR和Western blot检测干扰效率。　　 6、real-time PCR(SYBR Green method)　　 对于新鲜培养的细胞或新鲜肺癌组织采用RNeasy plus Mini kit提取总RNA.使用SYBR Green PCR master mix进行定量real-time PCR扩增，总体积20μl。使用7900HT实时定量PCR仪。　　 7、Westem blot法检测蛋白表达　　 收集细胞并加入裂解液充分裂解，提取上清为总蛋白。凝胶电泳、转印、室温封闭抗体4℃孵育过夜。二抗室温孵育2h显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集进行灰度测定。　　 8、细胞增殖能力实验　　 使用Cell Counting Kit-8(R) solution(Dojindo，Gaithersburg，MD)检测细胞的增殖能力.　　 9、细胞侵袭能力检测　　 使用24孔Transwell小室，孔径8μm(Costar)进行细胞侵袭能力检测随机选取10个高倍镜视野取平均值。每个实验组重复三次实验。　　 10、数据分析　　 采用SPSS16.0统计软件分析。　　 结果：　　 1、Mig-6蛋白表达的临床意义　　 我们用免疫组化的方法检测了150例非小细胞肺癌及其癌旁正常组织中Mig-6和EGFR蛋白表达情况。EGFR主要在细胞膜上表达，Mig-6主要在细胞浆和细胞核中表达。Mig-6的表达通过分析其在胞浆表达、胞膜的表达以及联合分析胞浆和胞膜的表达情况。　　 在正常支气管上皮中Mig-6表现出胞浆和胞核的强阳性表达而在肿瘤细胞中Mig-6的蛋白表达下调。我们又分析了Mig-6的表达和临床病理因素之间的关系发现，Mig-6的下调与患者的年龄(p=1.000)、性别(p=0.324)和淋巴结转移(p=0.323)无显著关系。我们发现Mig-6的表达和TNM分期(p=0.014)、肿瘤大小(p=0.002)存在关系。而且我们发现了Mig-6的低表达和肿瘤的低分化有关(p=0.002)，在腺癌中Mig-6的阳性率要高于鳞癌(p=0.005)。我们同时检测了非小细胞肺癌中Mig-6和EGFR的表达关系。EGFR在鳞癌中的阳性表达率(76.20％)要远远高于腺癌(40.82％)。这和总的Mig-6的表达情况正好相反。Mig-6和EGFR蛋白表达情况呈负相关(p=0.005)。　　 2、干扰Mig-6促进了肺癌细胞系的增殖能力。　　 首先我们在肺癌细胞系中用western blot分别分析了Mig-6、EGFR、p-EGFR蛋白表达情况。Mig-6的表达和EGFR及p-EGFR存在负相关的关系。在Mig-6高表达细胞系H1299，BE1，LH7，H460和LK2中，大部分EGFR的磷酸化都处于低水平。与之相反Mig-6低表达的A549和LTE细胞则表现出EGFR、p-EGFR的高表达。我们使用Mig-6特异性siRNA干扰其在H1299和BE1的表达，干扰后48h开始检测Mig-6mRNA及蛋白的表达情况，并连续检测了四天以确保干扰的有效性。我们发现干扰Mig-6后无论外源是否加入EGFR的配体EGF均能促进肺癌细胞的增值能力。　　 3、干扰Mig-6能上调MMP-2和MMP-9的表达水平并促进EGF诱导的肺癌细胞侵袭。　　 为了检测干扰Mig-6对肺癌细胞侵袭能力的影响，我们进行了侵袭实验发现:下调Mig-6对加EGF入EGF和未加入EGF的肿瘤细胞的侵袭能力都有促进作用。MMP家族成员由于在能够降解细胞外基质，在各种肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，因此我们又检测了干扰Mig-6后MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白的表达情况。我们发现干扰Mig-6在H1299和BE1细胞中能促进MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白的表达。　　 4、干扰Mig-6能在肺癌细胞系中激活EGFR信号通路。　　 为了检测Mig-6下调和肿瘤进程的关系我们在H1299和BE1细胞中使用Mig-6特异性siRNA并检测了EGFR，p-EGFR，p-AKT和p-ERK的表达情况。外源加入EGF可以上调p-EGFR，p-AKT和p-ERK的表达水平。干扰Mig-6能同时增加EGF处理组和非处理组p-EGFR和EGFR表达水平。同时相比对照组，干扰Mig-6组表现出高水平的p-AKT和p-ERK。　　 5、EGFR突变和Mig-6表达之间的关系。　　 为了检测EGFR突变和Mig-6表达之间的关系，我们选取了75例非小细胞肺癌组织，同时检测了EGFR突变情况及EGFR和Mig-6表达情况。75例中的16例检测到了EGFR存在突变，这其中有12例Mig-6表达缺失。Mig-6和EGFR表达的关系在表5中显示，Mig-6的表达缺失和EGFR的突变相关(p=0.023)。　　 讨论：　　 最近的研究表明Mig-6在肺的正常形态方面有重要作用。在多种肿瘤中均发现Mig-6的下调现象，它的低表达和EGFR通路持续激活有关并促进肿瘤的发生。基因敲除Mig-6的小鼠可以引起肺癌的发生。然而Mig-6在肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系尚未见报道。在本研究中我们发现Mig-6在肺癌中表达明显低于其在癌旁正常支气管上皮中的表达。Mig-6的表达下调和肿瘤的类型、分化程度、EGFR表达水平有关。此外我们还证实了干扰Mig-6可以在肺癌细胞系中促进EGF诱导的肿瘤细胞增殖和侵袭。　　 以前曾报道过Mig-6在各种肿瘤组织中均有下调，Mig-6在肺癌细胞系中存在突变。我们的实验证实Mig-6在肺癌组织中表达下调Mig-6的下调与肿瘤的组织学类型、分化程度及TNM分期有关。我们在肿瘤细胞的胞浆和胞核中均检测到Mig-6的蛋白表达这和以前在子宫内膜癌及甲状腺癌中的发现一致。　　 我们同时证实了Mig-6的下调和EGFR的过表达显著相关，这提示在肺小细胞肺癌组织中Mig-6可能是EGFR通路的负向调控因子。虽然在某些鳞癌中Mig-6被检测出高表达，但在这些病例中EGFR的表达非常低，进一步证实了Mig-6与EGFR的负相关关系。在许多肺癌细胞系中也同样检测到Mig-6与EGFR的负相关关系。另外在肺癌细胞系H1299和BE1细胞中干扰Mig-6可以同时上调EGFR和p-EGFR的蛋白水平。以前关于Mig-6的表达和EGFR突变之间的研究表明Mig-6与EGFR的磷酸化激活状态有关，提示Mig-6可能是EGFR非正常激活的一个内在的负向调控因子。总之，这些发现证明了Mig-6在非小细胞肺癌中是EGFR的负向调控因子。　　 以前报道过Mig-6在多种细胞系中可以促进肿瘤分子的生长。但Mig-6在肺癌细胞系中的生物学功能的研究至今未见报道。我们发现干扰Mig-6能在肺癌细胞系H1299和BE1中促进细胞的增殖，因此Mig-6的缺失有促进肿瘤细胞增殖的能力。同时干扰Mig-6还能促进肿瘤细胞的侵袭能力，并伴有MMP-2和MMP-9表达水平的升高。这些结果显示Mig-6对肺癌细胞的增殖和侵袭有显著的抑制作用。　　 然而Mig-6是如何促进肺癌细胞增殖的呢？在恶性胶质母细胞瘤中Mig-6的缺失能导致EGFR及其下游的酪氨酸激酶(RTK)信号的扩增.因此我们检测了干扰Mig-6后细胞中p-EGFR，p-AKT和p-ERK的表达水平。我们发现使用特异性siRNA干扰Mig-6后能激活p-EGFR以及EGFR-AKT和EGFR-ERK信号通路。p-EGFR，p-AKT和p-ERK已被证明能够促进肿瘤细胞的增殖、存活，抑制肿瘤细胞的凋亡，并与肺癌的不良预后相关。因此，Mig-6可能是通过抑制EGFR-AKT和EGFR-ERK信号通路来抑制肿瘤的进程的。　　 EGFR的突变和EGFR的表达、EGFR的下游信号以及患者对抗肿瘤药吉非替尼的临床治疗的反应密切相关。我们检测了Mig-6的表达和EGFR突变之间的关系。我们发现在大部分(75％) EGFR突变的病例中未检测到Mig-6的表达，Mig-6的表达和EGFR的突变成负相关。这与以前在恶性胶质母细胞瘤中EGFR的突变与Mig-6的缺失之间的研究结果相吻合。在EGFR突变的病例中Mig-6可能起到激活和稳定野生型EGFR信号的作用。在早期的研究中EGFR酪氨酸酶抑制剂类药物对EGFR突变的患者，尤其是亚洲地区组织学类型为腺癌的不吸烟的女性有高度敏感性。Mig-6是EGFR信号过度激活的内在负向调控因子，可能起到对EGFR信号分子检测的作用。Mig-6可以作为预测EGFR通路活性的新的生物学标记物。　　 结论：　　 本研究首次报道了在非小细胞肺癌组织中Mig-6与EGFR的关系，明确了Mig-6在肺癌细胞系中的生物学功能及其作用机制。因此Mig-6可作为检测非小细胞肺癌中EGFR信号通路激活情况的潜在的生物学标记物