人体的整体功能上的协调统一是通过细胞与细胞间的相互识别、联络和相互作用而实现的，这种存在于细胞内和细胞间的识别、联络和相互作用，又在多个层次上具有交叉调控，形成了一个十分复杂的信号网络系统。我们把细胞接受外界信号，通过一整套特定的机制，将胞外信号转导为胞内信号，最终调节特定基因表达，并引起细胞的应答反应称为细胞信号转导。细胞的种种功能活动受到复杂的信号转导通路的调控，精细调节的信号转导是正常生命活动的前提，而信号转导异常可以导致病理过程。许多研究表明，如果控制细胞增殖、分化的信息传递通路中某一环节异常，就会引起细胞生长失控，可以导致肿瘤形成或者肿瘤凋亡。在介导肿瘤细胞凋亡的众多信号转导途径中，以PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信号转导途径对凋亡的调节作用尤其重要。PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与血管形成，在肿瘤的形成中扮演重要角色，并参与肿瘤的侵袭和转移。而且该信号传导通路还通过诱导肿瘤细胞生存、分化和血管形成，在恶性肿瘤的发生发展和耐药方面发挥重要作用，也因此成为肿瘤干预治疗的新靶点。胆管癌主要指源于肝外胆管的恶性肿瘤，预后不佳。流行病学少见，国外尸检发现率为0.01％～0.5％，占恶性肿瘤总数的3％，我国尸检占0.07％～0.3％，其检出率逐年增高。而临床上对胆管癌的治疗颇为棘手。进一步探讨PI3-K/Akt/PKB通路的调节以及与其他通路的交联，提高对该通路在胆管癌中的作用的认识，有助于更好地理解其恶性行为，并针对该信号传导通路寻找新的抗肿瘤药物，对于胆管癌的治疗将具有十分重要的意义。在邹声泉教授的领导下，我们课题组在前期的研究中通过对胆管癌肿瘤生物学特性的研究有了深入的研究，认识到胆管癌中有癌基因k-ras、c-erbB-2和c-myc，抑癌基因PTEN、p53、DPC4/Smad、p15和p16以及凋亡相关基因bcl-2和bax的突变、缺失或过表达，在肝外胆管癌的分子细胞遗传学研究取得了很大的进展，而我们也从前期研究的与胆管癌发生、发展和转移相关的基因出发，结合与肿瘤的形成、凋亡和转移，并在恶性肿瘤的发生发展和耐药方面发挥重要作用的信号转导通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR出发，对该信号转导通路在胆管癌的凋亡及对化疗增敏作用做出一些探讨和研究。为肝外胆管癌的诊断和治疗探讨新的理论基础和实验依据。但由于时间的关系，我们的实验尚局限于较浅的层面，在今后的工作中我们将作进一步深入研究。第一部分：肝外胆管癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表达论文1．肝外胆管癌mTOR、Akt和PTEN的表达及生物学意义目的研究PI3K/PTEN/AKT/mTOR信号转导通路中mTOR、Akt和PTEN蛋白在胆管癌中的表达，及其在胆管癌发生，发展中的作用。方法1．用免疫组织化学方法，分析了36例胆管癌及癌旁组织胆管癌中mTOR、Akt和PTEN的表达；2．提取mRNA，运用RT-PCR法检测了三者的表达。结果1．PTEN蛋白定位于细胞浆，也可在胞核中表达，阳性细胞弥漫分布。Akt、mTOR主要在胞浆表达。胆管癌组织中PTEN蛋白表达的阳性率为47.2％（17/36），明显低于癌旁组织的86.1％（31/36），两者差异有显著性差异（P＜0.01）；Akt在胆管癌组织中表达的阳性率为86.1％（31/36），明显低于癌旁组织的52.8％（19/36）；mTOR在胆管癌组织中表达的阳性率为83.3％（30/36），明显高于癌旁组织中的41.7％（15/36）。结果显示：胆管癌组织中Akt、mTOR的表达比正常组织显著增加，PTEN表达显著减少。Akt与PTEN的相关性检验γ=0.862，呈明显负相关；而mTOR与PTEN的相关性检验γ=0.801，也呈明显负相关；Akt与mTOR的相关性检验γ=0.911，呈明显正相关。2．mTOR、Akt和PTEN的RT-PCR实验结果：mTOR在胆管癌组织中明显较正常组织中增加，灰度分析（Bandscan3.0）胆管癌组织中的mTOR的表达是正常组织中的1.52倍，差异显著（p＜0.01）；Akt的表达胆管癌组织中明显较正常组织中增加，灰度分析（Bandscan3.0）胆管癌组织中的Akt的表达是正常组织中的1.66倍，差异显著（p＜0.01）；PTEN在胆管癌组织中的增加明显下降，灰度值（Bandscan3.0）分析结果显示其表达与正常组织比较为0.78，显著差异（p＜0.01）。结论1．PTEN较正常对照的胆管组织的高表达是降低的，而mTOR和Akt的表达是升高的；2．PTEN和Akt、mTOR的关系密切，并呈负性相关，说明了PTEN的失活性，Akt和mTOR的低表达在胆管癌的生长增殖中是有一定作用的，并且有密切的关系。第二部分：PTEN-PI3K/AKT信号转导通路与mTOR信号转导通路的关系论文2．体外转染PTEN抑制胆管癌QBC₉₃₉细胞生长及下调mTOR表达的研究目的研究信号转导通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN体外对胆管癌QBC₉₃₉细胞生长的抑制作用，及对下游mTOR表达的影响。方法1．用携带有野生型PTEN和突变型PTEN的真核表达载体及空载质粒转染QBC₉₃₉；2．用Western blot检测转染后PTEN蛋白的表达及蛋白激酶B磷酸化的变化；3．流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡情况；4．检测转染后下游mTOR蛋白的表达。结果1．质粒转染后PGZ21-σXZ-PTENwt，PGZ21-σXZ-PTEN-C124S及空载质粒转染细胞后，于荧光显微镜下观察，可见转染成功的细胞呈明显的绿色。2．转染野生型PTEN，突变型PTEN，空载质粒及未转染细胞1，2，3，4，5，6，7d后绘制细胞生长曲线明显可见转染野生型PTEN组细胞的生长可速度明显减慢，而未转染组和转染空载体质粒组无明显变化。3．转染野生型PTEN基因后，其表达明显升高，与转染突变型PTEN基因后有明显差异；转染野生型PTEN基因后，AKT和mTOR的表达也明显下降，与其他3组有明显差异。4．流式细胞术检测可见，野生型PTEN转染组的细胞凋亡率达（21.3％±2.3）％，转染突变型PTEN组的细胞凋亡率达（10.3％±1.9）％，与对照组相比明显升高（P＜0.01）。而转染空质粒组的凋亡率无明显变化。结论1．将携带有绿色荧光蛋白GFP的野生型PTEN导入QBC₉₃₉细胞中，发现细胞的PTEN蛋白的表达增强，磷酸化AKT的表达明显降低；而转染不具有磷酸酶活性的突变型PTEN的QBC₉₃₉细胞虽然PTEN的表达也增强，但AKT的表达无明显改变。说明PTEN对肿瘤细胞的调控与脂质酶的磷酸化有密切关系。2．转染前后肿瘤细胞的凋亡率有显著意义的改变也提示PTEN可使细胞停滞于G1期。3．转染前后mTOR相应的改变说明，PI3K/AKT/PTEN与mTOR信号转导通路的关系密切。4．PTEN作为一种重要的抑癌基因对胆管癌细胞体外作用有重要影响，其主要的机制可能是通过PI3K/AKT/PTEN信号转导通路，作用于蛋白转录和翻译有重要调控作用的关键产物mTOR，对其产生直接影响。论文3．pcDNA3.1-mTOR表达质粒的构建及鉴定目的构建人mTOR基因的真核表达质粒pcDNA3.1-mTOR，并进行鉴定。方法1．用RT-PCR法扩增mTOR的全长cDNA；2．将空载质粒pcDNA3.1和扩增的mTOR用分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，玻璃奶回收，纯化，连接；3．接种于LB培养基中，运用酶切，进行PCR鉴定；4．DNA测序分析。结果1．通过FCR电泳，可见泳道B的产物为1Kbp，与预计相同；泳道C的短片段与B一致，长片段与泳道E相同，约为5.4Kbp；而泳道D的产物落后于C和E，说明其长度大于5.4Kbp，初步判断，重组质粒成功。2．DNA测序可以见到序列与Gene Bank查询结果一致，说明重组质粒成功。结论通过RT-PCR法扩增mTOR的全长cDNA，将空载质粒PCDNA3.1和扩增的mTOR用分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收，纯化，连接，并运用PCR鉴定，DNA测序分析，构建成功人mTOR基因的真核表达质粒pcDNA3.1-mTOR。论文4．pcDNA3.1-mTOR质粒体外转染胆管癌细胞目的研究信号转导通路mTOR体外对胆管癌QBC₉₃₉细胞生长的抑制作用，及对抑癌基因PTEN的负反馈调节影响。方法1．用pcDNA3.1-mTOR真核表达质粒及空载质粒转染QBC₉₃₉；2．用Western blot检测转染后mTOR蛋白的表达；3．流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡情况；4．检测转染后PTEN蛋白的表达。结果1．用pcDNA3.1-mTOR真核表达质粒及空载质粒转染细胞后，PCR鉴定转染成功。2．转染pcDNA3.1-mTOR真核表达质粒和空载质粒及未转染细胞1，2，3，4，5，6，7d后绘制细胞生长曲线明显可见转染组细胞的生长速度明显增快，而未转染组和转染空载体质粒组无明显变化。3．转染mTOR基因后，mTOR，AKT蛋白表达增加，而PTEN蛋白的表达明显下降，与未转染组有明显差异；4．流式细胞术检测可见，转染组的细胞凋亡率为（4.3％±0.8）％，未转染组的细胞凋亡率达（8.2％±1.3）％，与对照组相比降低明显（P＜0.05）。结论1．转染成功后，胆管癌细胞的生长明显增快，说明mTOR的增高可促进胆管癌细胞的生长，为mTOR的特异性的抑制剂的运用提供了证据；2．用携带有mTOR的质粒转染QBC₉₃₉细胞后，发现细胞的PTEN蛋白的表达增强；转染前后PTEN的这种明显的改变，说明mTOR可能通过PI3K/AKT/PTEN与mTOR信号转导通路负反馈调节PTEN的表达。第三部分：rapamycin和LY294002对胆管癌细胞凋亡抑制作用和化疗增敏作用的研究论文5．磷酸化抑制剂对PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路的作用及对胆管癌化疗增敏作用的研究目的运用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）LY294002[22（42吗啉基）282苯基24氢212苯并吡喃242酮]作用于胆管癌细胞系QBC₉₃₉，探讨抑制PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌化疗的增敏作用；并探讨PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡抑制作用。方法1．运用MTT法检测单独使用5-FU，MMC，CELECOXIB，联合磷酸化抑制剂LY294002，体外对胆管癌细胞系QBC₉₃₉的抑制作用；2．运用流式细胞技术检测QBC₉₃₉凋亡抑制率。结果1．MTT实验结果可以看出，联合使用LY294002的3个实验组比单独使用组有明显差异，联合使用LY294002组的IC50明显增高，差异有显著意义（p＜0.01）。2．流式结果检测显示，联合运用LY294002的3个实验组的胆管癌细胞的凋亡率明显增高，较单独使用组凋亡率明显增高，差异有显著的统计学意义（p＜0.01）。结论1．磷酸化抑制剂LY294002能有效的提高化疗药物5-FU，MMC，CELECOXIB体外对QBC₉₃₉细胞抑制作用的敏感性，通过抑制PI3K/AKT信号转导通路，抑制其激活来增强胆管癌细胞的化疗效果2．联合运用LY294002胆管癌细胞较单独使用组凋亡率明显增高，说明抑制PI3K介导的信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡有抑制作用。论文6．mTOR特异性抑制剂rapamycin抑制胆管癌细胞生长的研究目的运用mTOR特异性抑制剂rapamycin作用于胆管癌细胞系QBC₉₃₉，探讨抑制PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌化疗的增敏作用；同时探讨PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡抑制作用。方法1．运用MTT法检测单独使用5-FU，MMC，细胞联合磷酸化抑制剂LY294002，体外对胆管癌细胞系QBC₉₃₉的抑制作用；2．运用流式细胞术检测QBC₉₃₉凋亡抑制率。结果1．MTT实验结果可以看出，联合使用rapamycin的3个实验组比单独使用组有明显差异，联合使用rapamycin组的IC50明显增高，差异有显著意义（p＜0.01）。2．流式结果检测显示，联合运用rapamycin的3个实验组的胆管癌细胞的凋亡率明显增高，较单独使用组凋亡率明显增高，差异有显著的统计学意义（p＜0.01）。结论1．mTOR特异性抑制剂rapamycin能有效的提高化疗药物5-FU，MMC，CELECOXIB体外对QBC₉₃₉细胞抑制作用的敏感性，通过抑制mTOR信号转导通路，抑制其活性来增强胆管癌细胞的化疗效果2．联合运用rapamycin胆管癌细胞较单独使用组凋亡率明显增高，说明抑制mTOR介导的信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡有抑制作用。小结本课题立足于信号转导通路，初步探讨了PI3K/AKT/PTEN信号转导通路和mTOR信号转导通路的密切关系，并着重研究了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR和重要的抑癌基因PTEN在整个转导过程中的重要作用及相互关系，并且探讨了PI3K的特异性的磷酸化抑制剂对PTEN的影响，探讨了mTOR的特异性的抑制剂对信号转导通路的影响，得出结论如下：1．通过实验，我们确定了PI3K/AKT/PTEN信号转导通路与mTOR信号转导通路在抑制细胞凋亡，促进细胞生存方面关系密切以及他们明确的上下游之间的正反馈和负反馈的密切关系；2．本实验重点研究了抑癌基因PTEN和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR的密切关系，从蛋白水平，mRNA水平找出了两者有密切关系，并且通过质粒转染PTEN，得出mTOR的表达下降，转染mTOR质粒，而PTEN表达下降，从正反两个角度进一步确定了PTEN和mTOR呈负相关的密切关系；3．通过本实验确定了PI3K的特异性抑制剂对化疗药物的增敏作用并可诱导胆管癌细胞调亡的作用，使我们了解道PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路在胆管癌细胞凋亡抑制作用中可能起到重要的调节作用；4．mTOR信号转导通路的重点研究，使mTOR的特异性的抑制剂rapamycin的抗肿瘤作用的有了理论依据，并致力于为化疗效果不甚理想的胆管癌寻找新的增加化疗效果的靶点；5．在国内领先构建了mTOR的真核质粒载体，为进一步深入研究PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路提供了有力的帮助。