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α-Synuclein是一种重要的帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)相关蛋白，部分家族性PD患者中存在α-synuclein基因的突变，无论家族性或散发性PD，其特征性包涵体—Lewy体的主要成分都是α-synuclein蛋白，这些证据使α-synuclein成为研究PD发病的一个热点。但目前α-synuclein蛋白的生理功能及其在PD发病中的作用机制仍不十分清楚。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是近几年发展起来的一种利用同源双链RNA沉默目的基因表达的新方法，具有快速、有效、容易操作和特异性强等优点，目前已经成为有力的基因功能研究工具。本研究拟通过RNAi的方法沉默MN9D细胞α-synuclein基因的表达，观察其对细胞活力以及酪氨酸羟化酶表达、多巴胺生成的影响，进而了解α-synuclein的生理功能，并为探讨其在PD发病中的作用机制提供新的证据。
本研究利用载体(pENTRTM/H1/TO)介导的RNAi抑制MN9D细胞α-synuclein基因表达。根据RNAi序列设计原则，选取了两段干扰片段(SH1/α-SYN，SH2/α-SYN)及一段阴性对照序列(SH/CON)，并构建了相应的siRNA表达载体(pSH1/α-SYN，pSH2/α-SYN，pSH/CON)。经测序确定质粒中干扰片段的序列正确后，将三组质粒分别转染MN9D细胞，并通过筛选获得稳定的细胞克隆，将这些克隆扩增培养，鉴定RNA干扰的效率。半定量RT-PCR及免疫细胞化学显示，转染pSH2/α-SYN的细胞α-synucleinmRNA及蛋白量明显减少，而转染pSH1/α-SYN和pSH/CON的细胞α-synucleinmRNA及蛋白量与正常MN9D细胞没有明显差别。实时定量RT-PCR结果显示转染pSH2/α-SYN的MN9D细胞α-synucleinmRNA量比正常MN9D下降90％(p＜0.01)，这表明转染pSH2/α-SYN能有效抑制α-synuclein基因的表达，提示序列SH2/α-SYN是有效的干扰序列。我们将稳定转染pSH2/α-SYN和pSH/CON的细胞分别命名为MN9D/α-SYN-和MN9D/CON。
对细胞活力的检测发现MN9D/α-SYN-和MN9D/CON细胞的活力均比正常MN9D下降，但MN9D/α-SYN-的活力下降程度远高于MN9D/CON(p＜0.01)，这提示α-synuclein蛋白直接或间接与细胞活力相关。结合本实验室前期的研究，我们进一步检测了鱼藤酮作用24小时后三组细胞的活力，发现MN9D/α-SYN-的活力下降最明显，这表明抑制α-synuclein蛋白表达使细胞对鱼藤酮的毒性损伤更加敏感，提示α-synuclein蛋白对鱼藤酮的毒性损伤有一定抵抗作用。
近年来有文献报道α-synuclein蛋白可能通过影响酪氨酸羟化酶(TH)表达和/或活性参与多巴胺(DA)合成，但研究结果不甚一致，本实验对MN9D/α-SYN-细胞的THmRNA水平和蛋白表达量以及DA含量进行检测，发现MN9D/α-SYN-细胞的DA含量显著增高(p＜0.01)，是正常MN9D细胞的6.6倍，而实时定量RT-PCR和Westemblot结果显示TH基因表达量和蛋白量并没有改变，这提示MN9D/α-SYN-细胞中TH的活性可能增高，提示正常细胞中α-synuclein蛋白可能会抑制TH的活性，并进而抑制DA合成。同时我们还观察到MN9D/α-SYN-细胞DA代谢产物DOPAC的量并没有随DA相应增加，DOPAC/DA比值比正常MN9D细胞明显下降(p＜0.01)，这提示α-synuclein可能参与调节DA降解。
综上所述，本研究发现了一段能特异高效的抑制小鼠α-synuclein基因表达的干扰序列，并获得了稳定抑制α-synuclein基因表达的MN9D细胞，观察到抑制α-synuclein基因表达对细胞DA合成与代谢的影响。为进一步研究α-synuclein蛋白的生理功能及其在PD发病中的作用机制提供了良好的细胞模型和新的证据。