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第一部分目的：观察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)对卵巢癌细胞上皮-间充质转变的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：1.将含正义(Sense,Ss)或反义(Antisense,As)RKIP cDNA的表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞系,G418筛选阳性克隆,利用Western Blot进行鉴定,选取阳性克隆。2.应用Western Blot技术观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin蛋白表达的影响。3.应用实时荧光定量PCR观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin mRNA表达的影响。结果：1.筛选出稳定表达重组pcDNA3.1(+)-ss RKIP和pcDNA3.1(-)-as RKIP的SKOV-3细胞。2.Ss RKIP转染组细胞的间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞的间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。3.Ss RKIP转染组细胞的间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin的mRNA表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞的间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin的mRNA表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。结论：RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3细胞的上皮-间充质转变,其机制可能与上下调间充质细胞标志蛋白Fibronectin和Vimentin表达有关。第二部分目的：观察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)对卵巢癌细胞血管拟态的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：1.应用Matrigel三维培养模型观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞管道化塑形能力的影响。2.应用Western Blot技术观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中基质金属蛋白酶MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响。3.应用实时荧光定量PCR观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中基质金属蛋白酶MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2mRNA表达的影响。4.应用明胶酶谱分析法,观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中基质金属蛋白酶MMP-2/9活性的影响。结果：1.在三维培养条件下,Ss RKIP转染组细胞形成管腔样结构的能力明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞形成管腔样结构的能力明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。2.Ss RKIP转染组细胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。3. Ss RKIP转染组细胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。4. Ss RKIP转染组细胞中MMP-2/9的活性均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞中MMP-2/9的活性明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。结论：RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3细胞血管拟态的发生发展,其机制可能与下调细胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2表达和活性有关。第三部分目的：观察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)对卵巢癌细胞中上皮-间充质转变和血管生成调控因子影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：1.应用ELISA技术观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞的细胞因子VEGF、bFGF、 TGF-β和IL-8表达的影响。2.应用荧光素酶报告基因技术观察RKIP对人卵巢癌SKOV3细胞中转录因子NF-κB和AP-1转录活性的影响。结果：1.Ss RKIP转染组细胞的细胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞的细胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。2. Ss RKIP转染组细胞中转录因子NF-κB和AP-1的转录活性均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞；As RKIP转染组细胞中转录因子NF-κB和AP-1的转录活性均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。结论：RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3细胞中上皮-间充质转变和血管生成调控因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8的表达,其机制可能与下调细胞中转录因子NF-κB和AP-1的转录活性有关。第四部分目的：观察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)对人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型裸鼠体内肿瘤转移侵袭能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：1.建立裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型,观察RKIP对SKOV-3体内成瘤能力和腹腔转移能力的影响。2.应用小动物活体成像系统观察RKIP对人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型小鼠卵巢侵袭的影响。3.应用免疫组化的方法观察RKIP对人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型小鼠Vimentin、Fibronectin、E-cadherin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-κB)和c-Jun(AP-1)表达的影响。4.应用ELISA技术观察RKIP对人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型小鼠血清中细胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表达的影响。结果：1.裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型中,Ss RKIP转染组细胞的体内成瘤能力和腹腔转移能力明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组细胞;As RKIP转染组细胞的体内成瘤能力和腹腔转移能力明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组细胞和未转染的对照组细胞。2.裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型中,Ss RKIP转染组在活体成像中的荧光强度明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组和未转染的对照组；As RKIP转染组在活体成像中的荧光强度明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组和未转染的对照组,反映了Ss RKIP转染组细胞的体内侵袭能力低于As RKIP转染组细胞。3.人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型中,Ss RKIP转染组的E-cadherin表达明显高于空载体pcDNA3.1(+)转染组细胞和未转染的对照组,As RKIP转染组的E-cadherin表达明显低于空载体pcDNA3.1(-)转染组和未转染的对照组；Ss RKIP转染组的Vimentin、Fibronectin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-KB)和c-Jun (AP-1)表达明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组和未转染的对照组,As RKIP转染组的Vimentin、Fibronectin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、 p65(NF-KB)和c-Jun(AP-1)表达明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组和未转染的对照组。4.人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型裸鼠血清中,Ss RKIP转染组的细胞因子VEGF、bFGF、TGF-(3和IL-8表达均明显低于空载体pcDNA3.1(+)转染组和未转染的对照组；As RKIP转染组的细胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表达均明显高于空载体pcDNA3.1(-)转染组和未转染的对照组。结论：RKIP可抑制人卵巢癌SKOV-3腹腔转移瘤模型裸鼠体内肿瘤转移侵袭能力,其机制可能与上调蛋白E-cadherin表达,下调蛋白Vimenti、Fibronectin、CD44、 ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-KB)和c-Jun(AP-1)表达；下调细胞因子VEGF、 bFGF、TGF-β和IL-8分泌有关。