【摘 要】
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目的:分析L-型钙离子通道Cav1.2对骨形态发生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9）诱导的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）成骨分化的影响,并探究其可能的作用机制。方法:BMP9处理MSCs,qRT-PCR检测电压门控钙离子通道各亚型的基因表达水平,流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜观察BMP9刺激后MSCs胞内Ca2+浓
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目的:分析L-型钙离子通道Cav1.2对骨形态发生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9）诱导的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）成骨分化的影响,并探究其可能的作用机制。方法:BMP9处理MSCs,qRT-PCR检测电压门控钙离子通道各亚型的基因表达水平,流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜观察BMP9刺激后MSCs胞内Ca2+浓度变化,使用Cav1.2的激活剂Bay K8644和抑制剂Nisoldipine分别作用于BMP9诱导后的MSCs,细胞化学染色检测早期成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,qRT-PCR和Western blot分别检测晚期成骨标志物骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）和骨钙素（Osteocalcin,OCN）以及BMP9下游成骨相关靶分子Runx2、Id1、Id2、Id3的表达,Western blot检测Cav1.2对BMP9诱导的Smad1/5/9、Wnt/β-catenin和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases,MAPKs）信号途径的影响,结晶紫染色和MTT实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。包装Cav1.2的RNA干扰腺病毒Ad-si Cav1.2,qRT-PCR检测基因沉默效果,随后分析Ad-si Cav1.2对BMP9诱导的ALP活性和钙盐沉积的影响。结果:BMP9可以促进L-型钙离子通道亚型Cav1.2 mRNA的表达,并促进细胞Ca2+内流积聚增加。Cav1.2激活剂Bay K8644可增强BMP9所诱导ALP活性和钙盐沉积,进一步上调BMP9靶分子Id1、Id2、Id3和Runx2的表达,促进BMP9诱导的Smad1/5/9、β-catenin、p38和JNK磷酸化,但抑制ERK1/2磷酸化,而抑制剂Nisoldipine的效应与之相反。此外,Cav1.2激活剂Bay K8644和抑制剂Nisoldipine在培养早期对细胞活性和周期均无影响。RNA干扰Cav1.2能明显抑制BMP9诱导的间充质干细胞的ALP活性和钙盐沉积。结论:L型钙离子通道Cav1.2可能通过影响Smad1/5/9、Wnt/β-catenin及MAPKs信号通路活性而调控BMP9诱导的MSCs骨向分化。
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