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目的:观察稳定转染CDK2干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期、增殖活性及全蛋白质组表达的变化,以探讨CDK2在肝癌生物学进程中的作用,为肝癌发病机理的研究及其早期诊断、治疗提供新的、有效的分子靶点。
方法:应用分子生物学技术,构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGnesil-1-CDK2,并用脂质体介导法转染肝癌细胞株HepG2细胞,G418筛选阳性转染细胞克隆,检测其细胞周期、细胞生长曲线的改变,通过RT-PCR及双向凝胶电泳一质谱技术比较转染前后CDK2 mRNA的表达和全细胞蛋白质的变化。
结果:
(1)成功构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGenesil-1-CDK2,并用脂质体法导入肝癌细胞株HepG2细胞中,且有效表达,使HepG2细胞中CDK2 mRNA表达水平降低。
(2)CDK2干扰RNA转染HepG2细胞后,经G418筛选获得阳性克隆命名为PCDK2-siRNA-HepG2。与转染空质粒组的PHK-siRNA-HepG2细胞和未转染组的HepG2细胞相比,PCDK2-siRNA-HepG2组细胞的生长速度减慢,G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少。
(3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到10个差异表达的蛋白质。其中7种在稳定转染组细胞PCDK2-siRNA-HepG2中不表达,3种表达下调。
结论:
(1)成功构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGenesil-1-CDK2。
(2)CDK2干扰RNA可明显降低HepG2细胞CDK2 mRNA的表达,抑制HepG2细胞的增殖。
(3)质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期进展、信号转导、肿瘤转移和浸润等方面。