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【背景】结直肠癌是目前严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。由于早期结直肠癌缺乏典型的临床表现,因此许多患者一经诊断便已经是中晚期。局限性结直肠癌的5年生存率为90.3%,发生远处转移其生存率只有12.5%,手术切除治愈率有限。虽然以5-氟尿嘧啶、奥沙利铂及伊立替康为主的化疗及分子靶向药物西妥昔单抗的联合应用使部分转移性结直肠癌患者生存获益,但部分患者耐药的出现使得化疗失败,而目前关于化疗及分子靶向药物治疗耐药的机制仍然不清。miRNAs是一类广泛存在于真核生物的非编码RNA,其在调控肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。我们课题组前期发表在Nature Medcine上的文章发现在结直肠癌西妥昔单抗耐药的细胞中,miR-302a表达降低,提示其可能在结直肠癌恶行生物学行为的调控中发挥了重要作用。目前的研究也表明,miR-302在肿瘤中多表达下降,且调控多种肿瘤的增殖凋亡、侵袭转移及耐药。但是,miR-302a与结直肠癌恶性生物学行为的研究还较少。本研究探究了miR-302a对结直肠癌恶性生物学表型——增殖、转移、耐药的调控作用及可能的分子生物学机制。【目的】1.检测miR-302a在结直肠癌细胞和组织中的表达。2.检测miR-302a在结直肠癌恶行生物学行为中发挥的功能。3.探究miR-302a调控结直肠癌细胞转移和耐药的相关靶分子。4.探究miR-302a调控结直肠癌转移和耐药的机制。【方法】1.实时定量PCR检测正常结肠上皮细胞及多种结直肠癌细胞株中miR-302a的表达,以及结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织中miR-302a的表达差异。2.通过瞬转miR-302a mimic及antagomir,或稳转miR-302a过表达慢病毒载体构建miR-302a过表达及缺失模型。CCK-8法检测miR-302a对结直肠癌细胞增殖能力的影响。Transwell迁移及侵袭实验检测miR-302a对结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响。裸鼠尾静脉注射上调miR-302a的结直肠癌细胞检测miR-302a对结直肠癌体内转移能力的影响。CCK-8法检测miR-302a对奥沙利铂及西妥昔单抗治疗敏感性的影响。3D细胞培养模型检测miR-302a对西妥昔单抗耐药的影响。3.生物信息学预测3’UTR区有miR-302a结合位点的基因。荧光素酶报告基因验证miR-302a作用的直接靶基因。Western blot验证miR-302a对靶基因的蛋白表达影响。4.实时定量PCR、Western blot及免疫组化鉴定靶基因在结直肠癌细胞及组织中的表达。通过瞬转si RNA及稳转过表达慢病毒载体构建靶基因功能缺失及获得模型。Transwell法检测靶基因的表达对结直肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响。CCK-8法检测靶基因对西妥昔单抗治疗敏感性的影响。3D细胞培养模型检测靶基因对西妥昔单抗化疗耐药的影响。功能挽救实验检测靶基因与miR-302a的功能相关性。Western blot检测miR-302a与靶基因对下游效应分子的表达影响。【结果】1.实时定量PCR结果表明,与结肠正常上皮细胞相比,miR-302a在结直肠癌细胞中呈低表达;20对临床样本中,75%的患者肿瘤灶miR-302a的表达低于癌旁,肿瘤灶中miR-302a的平均表达水平低于癌旁约3倍。2.通过瞬转miR-302a mimic及antagomir,或稳转miR-302a过表达慢病毒载体可成功构建miR-302a过表达及缺失模型。CCK-8实验发现上下调miR-302a对结直肠癌细胞增殖能力没有影响。而Transwell实验发现上调miR-302a可抑制结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力,下调miR-302a可促进结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力。裸鼠尾静脉注射上调miR-302a的结直肠癌细胞后,结直肠癌体内转移能力下降。CCK-8实验发现miR-302a可促进奥沙利铂及西妥昔单抗治疗敏感性。3D细胞培养模型中发现上调西妥昔单抗耐药细胞系中miR-302a的表达,克隆数目减少。3.利用五个数据库的生物信息学预测发现,miR-302a可结合至多个基因的3’UTR区,NFIB在五个数据库中均被预测到有结合位点,CD44在四个数据库中被预测到有miR-302a的结合位点。荧光素酶报告基因证实miR-302a可直接结合至NFIB及CD44的3’UTR区,其中,NFIB有两个结合位点且均为核心结合位点,CD44有一个结合位点。Western blot证实上调miR-302a可抑制NFIB和CD44蛋白表达,下调miR-302a可促进NFIB和CD44蛋白表达。4.实时定量PCR、Western blot及免疫组化显示,NFIB在结直肠癌细胞及组织中表达升高。通过瞬转si RNA及稳转过表达慢病毒载体可成功构建NFIB功能缺失及获得模型。Transwell实验发现下调NFIB表达可抑制结直肠癌细胞系的迁移及侵袭能力,上调NFIB表达可促进结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力。功能挽救实验发现上调NFIB表达可逆转miR-302a抑制结直肠癌转移的能力。分析文献Ch IP的结果发现与转移密切相关的基因——ITGA6的启动子区有多个NFIB的结合位点,进一步通过Western blot发现NFIB可促进ITGA6的表达,miR-302a也可抑制ITGA6的表达。Transwell法证实ITGA6可促进结直肠癌细胞的迁移及侵袭。5.实时定量PCR、Western blot及免疫组化显示,CD44在结直肠癌细胞及组织中表达升高。通过瞬转si RNA及稳转过表达慢病毒载体可成功构建CD44功能缺失及获得模型。CCK-8实验及3D细胞培养模型均发现下调CD44表达可促进西妥昔单抗化疗敏感性。文献报道CD44可与肿瘤相关基因——EGFR发生相互作用,进一步通过Western blot发现CD44可促进EGFR的表达,miR-302a可抑制EGFR的表达。此外,Western blot也发现miR-302a可抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白(MMP-7、c-Jun、c-myc、activeβ-catenin、LEF1)的表达,并且抑制多药耐药蛋白P-gp表达。【结论】miR-302a在结直肠癌中的表达低于正常结肠细胞及组织。miR-302a不影响结直肠癌的增殖,但可抑制其转移、增加奥沙利铂及西妥昔单抗化疗敏感性。NFIB和CD44是miR-302a的直接靶基因。miR-302a抑制结直肠癌转移的机制主要是通过直接靶向抑制NFIB表达,进而抑制ITGA6的表达。miR-302a促进西妥昔单抗化疗敏感性的机制主要是通过直接靶向抑制CD44表达,进而抑制EGFR的表达。miR-302a促进奥沙利铂化疗敏感性的机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路并抑制了P-gp表达。