萌发是种子打破休眠期进入连续生长状态,并开始进行新的遗传程序(基因转录与表达)和物质同化能量代谢的过程。这一过程是否能够顺利进行对于保证种群顺利繁衍和进化,具有非常重要的生物学意义。大多数植物的种子在收获后会经过一段时间休眠才能萌发,这现象被称为是种子的休眠特性。种子休眠性是作物重要的农艺性状,与作物的品质和产量息息相关。低休眠的种子容易出现穗发芽,高休眠的种子又会造成播种季节的低萌发率,因此种子的最佳休眠水平对农业生产至关重要。种子的穗发芽既受遗传控制,又受环境(例如高温、高湿)影响,其调控的分子机制仍不清楚。因此通过遗传学、分子生物学等方法解析种子休眠与萌发的分子机制,为作物穗发芽的防控和耐穗芽种质资源的创制提供基础,这将成为未来解决作物穗发芽问题的关键。我们实验室前期通过RNA-seq的方法获得了在灌浆期受高温抑制的转录因子OsMYB3,OsMYB3是编码植物MYB类的转录因子。本实验前期利用组成型表达的Ubi启动子驱动OsMYB3基因获得纯合的超表达材料、以及利用双链RNAi干扰的手段获得OsMYB3基因的纯合RNAi材料。本论文在此基础上开展了对该基因的功能研究,并取得了以下研究进展:1.无论大田或者温室高湿条件处理下,超表达植株收获的种子会出现明显穗发芽表型,而RNAi材料的穗发芽率与野生型没有明显差异。2.利用CISPR/Cas9基因编辑的方法获得了OsMYB3的功能缺失的纯合突变体myb3-1材料。对myb3-1,RNAi和超表达材料新鲜收获的种子及打破休眠后后熟的种子分别进行种子萌发实验,结果发现:突变体myb3-1和RNAi的种子萌发速率均明显低于野生型(日本晴),而超表达材料成熟种子萌发速率则明显高于野生型,表明该基因可能正向调控种子的萌发。3.本实验室前期的研究结果表明OsMYB3基因的表达受节律调控且在发育的种子有高表达,本论文中,我们对种子不同萌发时期的基因表达进行了检测,结果显示:OsMYB3在种子萌发的过程中诱导表达。4.淀粉水解酶基因是种子萌发标记基因,本研究中,我们对野生型、myb3-1和超表达种子萌发不同时期的α-淀粉水解酶基因表达进行了检测,结果显示OsMYB3的存在能促进部分淀粉水解酶AMY1A、AMY1C、AMY3C等基因的表达,进一步表明OsMYB3可能正向调控种子的休眠与萌发过程。5.ABA和GA是参与种子休眠与萌发调控的两种最重要的激素,利用ABA和GA分别处理萌发期的种子,结果发现myb3-1突变体种子的萌发对GA不敏感、超表达种子的萌发对GA超敏感,而上述种子的萌发对ABA的敏感性没有明显差异,表明OsMYB3基因可能是通过GA信号途径来调控种子的休眠与萌发。6.本实验室前期的研究表明,OsMYB3蛋白没有转录激活功能,本论文中,我们利用酵母双杂的方法,在水稻胚乳cDNA文库中筛选OsMYB3的互作蛋白,激酶SnRK1A为其中一个能与其互做的蛋白。同时我们又筛选了水稻的转录因子库,筛选到2个与OsMYB3互做的蛋白。7.过去的研究表明,激酶SnRK1A参与低糖诱导的种子萌发途径,本研究中,我们未能在原生质体中检测到OsMYB3的表达受低糖诱导或高糖抑制,因此无法确定该基因是否参与低糖介导的种子萌发。8.利用Dual-LUC系统,我们在原生质体中同时表达了OsMYB3和SnRK1A,结果显示OsMYB3单独存在时可明显增强淀粉水解酶α-AMY1A驱动的报告基因的表达,但SnRK1A蛋白加入后,这种增强效果明显被抑制,推测SnRK1A可能会抑制OsMYB3转录激活功能,但确切的调控机制还需要进一步验证。综上,我们推测OsMYB3是种子萌发过程中的正调控因子,OsMYB3可能通过GA信号途径正调控淀粉水解酶基因的表达来调控种子的萌发。激酶SnRK1A能与OsMYB3相互作用,OsMYB3与激酶的互做抑制了该基因参与的转录激活功能,推测该基因的磷酸化会抑制其编码蛋白的活性。OsMYB3是通过什么分子途径促进种子萌发、OsMYB3直接结合的下游靶基因是什么、磷酸化和糖信号在OsMYB3介导的种子萌发中起何作用,等等问题都需要进一步用实验证实。未来我们将通过遗传学、分子生物学等方法解析OsMYB3参与种子休眠与萌发的分子机制,为作物穗发芽的防控和耐穗芽种质资源的创制提供基础。