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在细胞的氧化代谢过程中,不断产生各种活性氧。在细胞处于正常状态时,细胞内的抗氧化系统起着清除自由基的作用,使细胞处于一个氧化平衡状态。但当机体处于衰老、氧化应激或某些病理情况下时,活性氧产生增多或机体清除能力减弱,过量的活性氧对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰,损伤正常组织细胞的形态和功能。SOD是生物体防御活性氧毒害的关键性防线。研究表明,SOD与癌症等多种疾病之间有着极其密切的关系。本课题以杏鲍菇为原材料,通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法分离纯化了SOD,并通过UV、MALDI-TOF-TOFMS、ICP-MS、SDS-PAGE、HPLC等分析方法对该SOD的类型及纯度进行了鉴定。此外,通过单因素考察和正交实验的方法优化了SOD脂质体的制备工艺,并研究了所制得SOD脂质体的生物学功能。
本课题以杏鲍菇子实体为原料,分离纯化得到了液相纯的SOD,活性为3900U/mg,纯化倍数为177倍,回收率为13.0%。在提取过程中对超声破碎功率、破碎时间、层析顺序等因素进行了优化,最终选择的超声功率是160W,超声时间为9min。MALDI-TOF-TOF质谱仪测定结果显示,该SOD分子量为31503,亚基分子量为15790;ICP-MS显示该SOD含铜和锌而不含锰;紫外光谱显示该SOD在258nm处具有最大吸收;活性抑制实验结果显示该SOD对双氧水和叠氮钠敏感,而对SDS不敏感;这些证据均证明该SOD为Cu/Zn-SOD。
本文以脂质体的包封率及粒径为评价指标,在单因素考察磷脂与胆固醇比例、超声时间、水相pH值及水相体积对制备脂质体包封率影响的基础上,利用正交设计方法对SOD脂质体的制备工艺进行了优化。最终确定SOD脂质体的制备条件为PC∶CH=1∶1,pH值为8.2,超声时间为8min,水相体积为3mL。稳定性实验结果表明,所制备的SOD脂质体在2个月内渗漏率小于20%。
本文以制备得到的SOD脂质体作为药物,并以未包封SOD作为对照,研究了SOD脂质体抑制肝癌细胞生长的能力。结果显示,SOD脂质体能很好地抑制肝癌细胞hepG2和肝正常细胞L02生长,而未包封SOD则未显示出任何抑制作用。将白藜芦醇制成脂质体后,则发现包封前与包封后白藜芦醇抑制细胞生长作用的变化不大。对SOD脂质体作用后细胞内SOD活性及ROS含量的测定结果表明,加入SOD脂质体后,细胞内SOD活性增加,ROS含量减少。说明SOD抑制肝癌细胞生长的机理可能是SOD进入细胞并清除了细胞内的ROS,导致了细胞的凋亡,而未包封SOD因不能进入细胞而未能抑制肿瘤细胞生长。
本文的研究结果表明,杏鲍菇作为一种珍稀食药用菌,其子实体中提取的SOD经制备成脂质体后可明显抑制肿瘤细胞生长,对其进行进一步改进后将会有广阔的应用前景。