论文部分内容阅读
恶性肿瘤是我国人民生命健康的重要威胁之一,化疗是临床治疗恶性肿瘤的主要手段,但化疗药物难以突破体内生物学屏障、毒副作用大、易产生耐药,疗效欠佳。基于上述问题,近年来,肿瘤智能药物递送系统成为研究的热点,在一定程度上改善了化疗药物的体内行为及分布,提高了治疗效果。然而目前报道的基于肿瘤微环境（pH,GSH等）或微能量（近红外光,超声等）的智能药物递送系统大多受限于肿瘤的种类、发展程度、病变部位等,导致响应程度有限,不能快速大量释放药物,实现对肿瘤细胞的高效杀伤。基于上述问题,策略性的设计并构建肿瘤细胞特异分子标签识别-触发型的智能化药物递送系统是亟待解决的问题。本课题拟制备一种介孔纳米材料,通过其表面功能化修饰集分子识别与空间构象变化于一体的配体,同时实现肿瘤细胞分子特异识别与药物控释于一体,使其到达肿瘤细胞触发药物释放激活化疗。该药物递送系统主要由药物储库单元、智能识别及响应释药单元两部分组成。介孔二氧化硅纳米粒（Mesoporous Silica Nanoparticles,MSNs）因具有高度的生物安全性、简单的制备工艺、孔径可调、超大比表面积、易于表面进一步修饰及拥有超高的药物荷载量等优点用来作为药物储库单元。基于核酸适配体（Aptamer,APT）的目标特异亲和性,易于分子工程改造及构象可预测性等众多优点,将APT作为智能识别及响应释药单元。针对乳腺癌细胞表面特异标志物Mucin 1（MUC-1）设计并制备具有显著分子识别及构象变化能力的发卡状APT,构建肿瘤细胞分子标签识别-触发型的智能化药物递送系统。首先采用溶胶-凝胶法合成MSNs并对MSNs表面进行叠氮化修饰（MSNs-N3）,然后利用介孔大量装载抗肿瘤药物盐酸阿霉素（Doxorubicin Hydrochloride,DOX）,最后将特异性识别肿瘤细胞表面标签蛋白MUC-1且尾部修饰炔基的发卡状APT通过叠氮与炔基的点击化学反应共价连接到载药MSNs-N3表面。该发卡状APT一方面作为“门控”,避免DOX提前泄露,另一方面特异性识别MUC-1蛋白,靶向乳腺癌细胞。更重要的是,在特异性识别的同时诱导发卡状结构发生构象变化,打开介孔孔道,激活DOX的释放,作为智能响应释药的“开关”。通过上述过程最终制备了肿瘤细胞分子标签特异识别-触发型药物递送系统MSNs/DOX-APT。本研究利用透射电子显微镜和X-射线衍射仪等表征方法证明MSNs、以及MSNs-N3的成功制备。红外光谱和荧光光谱结果表明发卡状APT成功连到MSNs-N3表面。氮气吸附脱附结果表明,MSNs-N3纳米粒的比表面积为782.10m2/g,孔体积为0.54 cm3/g,平均孔道直径为2.31 nm,介孔大小适合装载DOX。通过高效液相色谱法（HPLC）测定载药率,证明纳米体系MSNs-N3能高效装载DOX,成功制备MSNs/DOX-APT,且载药率高达66%。本文以人乳腺癌细胞（MCF-7）为模型细胞,人正常乳腺细胞（Hs578bst）为对照细胞评价MSNs/DOX-APT的体外抗肿瘤活性及选择性。激光共聚焦显微镜结果表明,APT能有效识别高表达MUC-1蛋白的MCF-7细胞并发生构象变化,而不识别Hs578bst细胞。更重要的是,制剂在两种细胞中的释药结果也表明MSNs/DOX-APT能够选择性识别MCF-7细胞并释放大量药物,在Hs578bst细胞中药物几乎不释放。最终细胞活力结果表明,MSNs/DOX-APT（DOX浓度为5μg/mL）与MCF-7细胞和Hs578bst细胞作用72 h的细胞活力分别为24.8%和86.0%,说明纳米体系对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。细胞实验结果表明,构建的MSNs/DOX-APT纳米体系能够选择性激活肿瘤细胞的治疗,在一定程度上降低了正常细胞的毒副作用。最终,本研究使用MCF-7细胞建立荷瘤裸鼠动物模型初步评价该肿瘤特异激活型药物递送系统的体内抗肿瘤活性。通过小动物活体成像考察MSNs/IR783-APT在裸鼠体内的分布情况,结果证明具有识别能力APT修饰的MSNs/IR783-APT组可在肿瘤部位快速有效富集并长时间滞留。同时DOX在肿瘤细胞核定位实验结果表明,MSNs/DOX-APT能在肿瘤细胞中特异性释放药物。系统抗肿瘤药效学结果显示,MSNs/DOX-APT组相比于DOX组,肿瘤体积下降了1.5倍,表明构建的分子标签识别-触发型纳米体系能够被肿瘤细胞激活并开启化疗,实现治疗作用。病理学结果进一步证明了MSNs/DOX-APT对肿瘤组织的杀伤作用,且降低了DOX对正常组织的毒副作用。