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背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方及东南亚各国高发的恶性头颈肿瘤之一,其起病隐匿,极容易发生颈部淋巴结转移和远处转移,大部分患者在临床确诊时已处于中晚期。随着放疗技术的发展,早期鼻咽癌的治疗效果已得到提高,但有远处转移的鼻咽癌患者预后仍不理想,远处转移仍然是目前鼻咽癌治疗失败的主要原因。探索鼻咽癌远处转移的机制,寻找转移的生物标记和治疗靶点是目前鼻咽癌防治的可能突破点。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)是指从实体瘤或转移灶自发或因诊疗操作脱落至循环系统中的肿瘤细胞,是肿瘤发生远处转移的先决条件。在循环系统中找寻CTC并对其生物学特性进行研究有利于揭示肿瘤远处转移的机制。单细胞转录组分析技术能从单细胞层面研究CTC的生物学特性,从而揭示肿瘤转移机制。然而现有的利用上皮表型分选循环肿瘤细胞技术仍不能完全界定肿瘤细胞,限制了 CTC的临床应用,并给分析CTC的生物学特性带来偏倚。因此建立一个无偏倚的鼻咽癌CTC分离方法,基于此建立鼻咽癌单个CTC的cDNA文库,是鼻咽癌循环肿瘤单细胞转录组研究的关键。目的:建立鼻咽癌循环肿瘤细胞捕获和鉴定方法体系,并构建鼻咽癌循环肿瘤单细胞cDNA文库,以供下游Smart-seq2单细胞全长转录组测序。方法:本研究首先在鼻咽癌细胞系HONE1中按照Smart-seq2测序步骤建立细胞系单细胞cDNA文库,并用real-time PCR的方法检测mRNA的完整性,对cDNA文库进行质控。其次比较红细胞裂解液和淋巴细胞分离液去除血液红细胞的效果并评价两种方法对单细胞cDNA文库的影响;随后对鼻咽癌原发肿瘤组织及转移淋巴结组织进行免疫组化染色评价EpCAM和CK作为鼻咽癌CTC标志物的可行性;并进一步利用稳定表达绿色荧光的胃癌AGS-EBV-GFR细胞与健康人外周血按比例混合模拟鼻咽癌CTC模型,通过检测绿色荧光及DAPI染色后进行细胞计数评价EpCAM免疫磁珠获取CTC效率及特异性。最后从鼻咽癌患者外周血中分离CTC并进行单细胞cDNA文库构建,用RT-PCR方法检测单细胞EBV编码产物LMP2A的表达以确定单细胞来源于鼻咽癌CTC,并使用Bioanalyzer系统评价cDNA文库的质量是否符合Smart-seq2平台标准。结果:1、设计的 real-time PCR 引物 hmPOLR2A、hmPOLR2A-2 和hmPOLR2A-l能成功扩增目的片段,鼻咽癌细胞系构建单细胞cDNA文库RNA模板N端与C端起始浓度相近;2、红细胞裂解液和淋巴细胞分离液均能成功除去血液中红细胞,使用淋巴细胞分离液处理外周血构建单细胞cDNA文库成功率(50%)高于使用红细胞裂解液(16.7%);3、EpCAM和CK在正常鼻咽粘膜上皮细胞、鼻咽癌原发肿瘤组织与转移淋巴结组织中的肿瘤细胞均有表达,EpCAM表达于细胞膜表面,在转移灶中的表达低于原发灶;4、在利用AGS-EBV-GFR细胞模拟的CTC模型中,EpCAM免疫磁珠获取CTC效率可达56.7%,所获取的细胞100%绿色荧光阳性,均为AGS细胞;5、同一例鼻咽癌患者CTC单细胞cDNA文库LMP2A检测阳性率为80%(4/5);6、构建的鼻咽癌患者CTC单个细胞cDNA文库片段大小集中在600-2000bp,无或含少量500bp以下片段,符合Smart-seq2平台建库要求。结论:通过淋巴细胞分离液分离,结合EpCAM免疫磁珠正筛选及EBV编码产物LMP2A表达检测,可实现更大的无偏倚性分离捕获鼻咽癌CTC单细胞,由此建立的鼻咽癌CTC单细胞cDNA文库可应用于后续的Smart-seq2全长转录组测序分析。