论文部分内容阅读
苹果斑点落叶病（Apple Alternaria Blotch）是一种危害广泛的真菌病害,在我国各苹果产区均有发生,以渤海湾和黄河故道地区最为严重。苹果斑点落叶病由链格孢苹果专化型（Alternaria alternaria f.sp mali）侵染,主要危害苹果叶片,新稍和果实,影响树势,降低果实品质和产量。目前,对这些病害的防治方式仍以化学防治为主,但这无疑会造成环境污染并可能危害人类健康,而选择具有斑点落叶病抗性的苹果品种进行栽培或以此为父母本通过杂交育种的方式培育抗病新品种是解决这一问题的有效手段。通过多年的调查研究,我们发现不同苹果资源对苹果斑点落叶病的抗性存在差异,表现为金冠,元帅,红星,国光等品种抗性较弱,而寒富、鸡冠、红夏等抗性较强,但相关报道较少,其分子机制尚不明确。近几年研究表明,miRNA在植物抗感病途径中起到重要的调控作用,因此我们通过miRNA高通量测序分析苹果斑点落叶病感病品种,获得接菌后表达差异显著的miRNA,以此为基础以不同苹果资源和杂交群体为材料对斑点落叶病的抗病机制进行研究,并发现一个与苹果抗病性紧密相关的SNP位点可作为一个分子标记,为苹果抗病育种提供了方向。主要研究结果如下:1.对接种斑点落叶病菌（ALT1）苹果‘金冠’叶片,以接无菌水叶片为对照分别进行small RNA高通量测序,获得差异表达2倍以上的miRNAs或miRNA家族共60个,分为已知miRNA和新miRNA 两部分。在已知 miRNA 中,我们发现 Md-miR395（miRBase MIMAT0025980）和Md-miR156ab（miRBase MIMAT0025894）在接菌ALT1前后表达差异显著,且分别靶向两个不同的WRKY转录因子。2.我们从miRNA高通量测序中获得一个新miRNA中,表达差异最大,高达16.5倍,命名为Md-miRLn12,5’RACE 等实验表明其靶向并切割 MdRNL-1、MdRNL-2、MdRPW8-3 和 MdRPW8-4四个抗病基因。进一步研究发现Md-miRLn12、Md-miRLn12前体及其4个靶基因在接种ALT1的苹果感病品种和抗病品种中表达模式不同,感病品种Md-MIRLn12-277表达上调,与Md-miRLn12表达一致,MdRNL-1和MdRNL-2表达较低;相反,在抗病品种中Md-MIRLn12-277与Md-miRLn12表达水平较低,MdRNL-1和MdRNL-2则表达上调。同时,在感病品种‘金冠’中沉默Md-miRLn12或过表达MdRNL-1和MdRNL-2可提高抗病性;而在抗病品种‘寒富’中过表达Md-miRLn12或沉默MdRNL-1和MdRNL-2可降低抗病性。说明Md-miRLn12通过切割靶基因MdRNL-1和MdRNL-2调控苹果斑点落叶病抗性。3.为研究抗感病苹果品种中Md-miRLn12表达差异的原因,我们克隆并比较了‘金冠’、‘寒富’Md-miRLn12前体的启动子,发现三个SNP差异位点,分别是-1506bp的motif a（C-T）,-1186bp的 motif b（G-T）和-175bp 的 motif c（A-G）。当突变高感品种的 motif b 时,Md-MIRLn12-277启动子活性丧失,在3个苹果杂交群体中验证motifb的保守性,发现这一位点与苹果抗性紧密相关:进一步结合EMSA及LC-MS等方法发现苹果斑点落叶病高抗品种是由于MdWHy转录因子不能与Md-MIRLn12-277启动子motifb处结合导致Md-MIRLn12-277不能正常转录,Md-miRLn12不被诱导,靶基因MdRNL-1和MRNL-2表达量高,抗苹果斑点落叶病。4.Md-miRLn12 靶基因 MdRNL2 是一个CCR-NB-LRR 蛋白,利用 pull-down 与 LC-MS 结合的方法寻找与MdRNL2潜在互作并共同参与‘寒富’抗病途径的蛋白,获得一个仅有NB-LRR结构域的新蛋白（MdNL1）和两个病程相关蛋白（MdPR10-1和MdPR10-2）,通过酵母双杂、双分子荧光互补和瞬时表达等实验表明MdNL1与MdRNL2互作,形成复合体激活下游的MdPR10-1和MdPR10-2,同时MdPR10-1和MdPR10-2分别与MdNL1和MdRNL2互作,共同参与抗病品种‘寒富’的抗ALT1途径。因此,我们认为苹果斑点落叶病高抗品种是由于MdWHy转录因子不能与Md-MIRLn12-277启动子motif b处SNP结合导致Md-MIRLn12-277不能正常转录,Md-miRLn12不被诱导,靶基因MdRNL-1和MRNL-2表达量高。其中MdRNL2与MdNL1互作形成复合体激活下游的MdPR10-1和MdPR10-2,并且MdRNL2/MdNL1与MdPR10-1和MdPR10-2互作共同参与抗苹果斑点落叶病途径。