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木聚糖酶（Xylanase）是一类能专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖的水解酶，在制浆造纸、饲料、食品、酿酒等领域具有良好的应用前景，并可为能源短缺、环境污染等相关社会问题提供新的解决方式。木聚糖酶主要来源于枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、链霉菌等原核微生物和黑曲霉、里氏木霉、青霉、等真菌，但上述原始菌株产木聚糖酶的水平较低，难以达到工业化生产要求，从而限制了木聚糖酶在商业上的应用。有鉴于此，本研究根据毕赤酵母的偏爱密码子人工设计合成了编码链霉菌S38（Streotomyces sp.S38）木聚糖酶XYL1（Xlyanase1）的成熟肽基因，以X33为宿主菌，选用PGAP为启动子，构建组成型表达XYL1的工程菌株X33/pGAPZ A-XYL1。实验表明木聚糖酶XYL1基因成功插入表达载体pGAPZ A中，获得的重组载体pGAPZ A-XYL1，经电转化整合至毕赤酵母X33基因组DNA中。重组工程菌X33/pGAPZ A-XYL1传代稳定，连续传代10代无显著基因丢失，可满足补料分批发酵生产的需要；而连续传代15代的基因丢失率仅为10%。重组工程菌X33/pGAPZ A-XYL1产木聚糖酶活性在摇瓶水平为215±10IU/mL。发酵液离心收获的上清，经5kDa膜包浓缩置换缓冲液、Q-sephrose FF强阴离子交换层析和Sephadex G-25分子筛联用分离纯化，获得电泳纯度高于90%的重组木聚糖酶XYL1，比活力从796.80IU/mg提高到1328.69IU/mg。肽指纹图谱鉴定结果显示，纯化的XYL1与来源于链霉菌Streptomyces sp. S38的内切β-1,4木聚糖酶1（GenBank注册号X98518.1）完全匹配。实验表明重组木聚糖酶XYL1在耐热性方面具有比原酶更好的酶学性质，最适pH为6.0，在pH3.09.0时酶活保持稳定；最适反应温度为55℃，且45℃-65℃酶活相对稳定；在60℃处理30min后仍剩余63%的酶活力；重组木聚糖酶XYL1的催化反应机理可以用米氏方程描述，其νmax为5000μmol/min·mg prot，Km为2.0mg/mL。摇瓶实验比较了甘油、葡萄糖、甲醇这三种碳源对表达的影响，结果表明葡萄糖更适用作发酵的碳源，并确定了发酵初始葡萄糖最适浓度为30g/L。在5L罐中研究了工程菌X33/pGAPZ A-XYL1的连续发酵工艺，结果显示，工程菌发酵第5天进入稳定态：菌体浓度基本稳定在400g/L（WCW）水平，最大菌体产率DCx为8.14g/L.h（WCW）；木聚糖酶XYL1的表达水平稳定在1100IU/mL，木聚糖酶XYL1最大产率DCp达23028IU/L·h。残糖含量在发酵液中维持较低水平，平均为2.56g/L；DO一直稳定在30-40%。连续培养持续了17天，稀释速率D为0.48d-1，产物产率则为补料分批发酵的1.66倍。重组毕赤酵母在发酵过程中的的遗传稳定性较好，未出现明显的基因丢失现象；同时由于料液在反应器中平均停留的时间短，未见明显的蛋白酶降解XYL1的现象。以葡萄糖为限制性底物，通过5L罐的恒化培养，获得相关动力学参数，比生长速率μ与葡萄糖浓度Cs关系符合Monod方程，菌体生长动力学模型μ=0.35Cs（/0.38+Cs），其中μmax=0.35h-1，Ks=0.38g.L-1；比生长速率μ与比产物形成速率的关系呈钟罩型曲线，XYL1生成动力学模型qp=-0.0529μ2+0.0168μ-0.0003（0.024≤μ≤0.212）；底物消耗动力学模型，qs=1.6025μ+0.0277；理论最大菌体对葡萄糖得率为YG=0.624g/g，维持系数m=0.0277g/g.h；通过比生长速率μ与菌体生产率DCx的关系研究，推导出最佳稀释速率Dopt=0.316h-1，实验预测的最大菌体生产率（DCx）m=7.509g/L·h。对μ与产物生产率DCp的关系进行了研究，μ与产物生产率DCp的关系和μ与qp的关系类似，其峰值出现在μ=0.156h-1。从菌量、产量、菌体得率系数（YX/S）、产物得率系数（YP/S）和比产物形成速率（qp）等动力学参数出发，在50L发酵罐中比较了间歇流加、恒速流加和指数流加等不同流加模式对毕赤酵母工程菌X33/pGAPZ A-XYL1生长和重组XYL1表达的影响，结果显示指数流加是该工程菌高密度发酵的最优的流加模式。在上述指数流加发酵的基础上进一步优化，并采取分段控制工艺进行发酵，最终发酵菌体湿重达415g/L，酶活达2788IU/m L，发酵水平比单纯的指数流加提高了20%。采用分段控制工艺在10m3生产罐上进行三批次发酵放大试验，平均放罐体积8.152m3，最高菌湿重达到486g/L，最高酶活3420IU/m L。上述结果表明分段控制工艺放大效果良好，三批次间发酵差异较小，发酵产酶水平比50L罐发酵规模提高了23%，总体工艺稳定。