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ClC-3氯通道属于电压门控型氯离子通道。研究表明ClC-3在成骨细胞和破骨细胞中表达,且其过表达可促进骨矿化因子的分泌[1]。同时ClC-3在破骨细胞中通过调节细胞酸化来促进骨吸收[2]。此外ClC-3氯通道在小鼠的牙胚中也有所表达,其mRNA在成釉细胞类细胞LS-8和成牙本质类细胞MDPC-23中表达。但是ClC-3对骨骼和牙发育得影响并没有详细报道。此次试验我们主要观察ClC-3对颅颌骨和牙发育的影响。我们首先利用BALB/c小鼠来验证CLC-3在牙胚中的表达与分布,基于此预试验的结果,我们建立了ClC-3基因缺陷的斑马鱼动物模型,观察ClC-3氯通道基因缺陷对牙齿和骨骼发育的影响。具体实验内容如下:1、选取出生前孕13.5 d、15.5 d、18.5 d的BALB/c胎鼠和出生后1 d、5 d的BALB/c仔鼠,进行常规的组织处理、石蜡包埋和系列的切片,在对石蜡切片进行CLC-3免疫组化染色,观察CLC-3蛋白在小鼠牙胚中的分布与表达。2、分析斑马鱼的clcn3基因结构特征,设计并合成clcn3特异的Morpholino,摸索斑马鱼clcn3 Morpholino的最佳显微注射浓度,建立ClC-3基因缺陷的斑马鱼动物模型,并观察注射后斑马鱼的一般性状及特异性的颅颌骨和牙齿的改变。实验结果如下:1、CLC-3蛋白在小鼠胚胎第15.5 d到出生后五天的下颌第一磨牙均有表达,且随着不同的发育阶段表达特点也不一样。在小鼠牙胚发育为蕾状期时表达于口腔上皮细胞,帽状期时在牙乳头和牙囊细胞中表达。钟状晚期及小鼠出生后可见CLC-3蛋白在牙乳头细胞、牙囊细胞、成釉细胞、成牙本质细胞和星网状层细胞、中间层细胞广泛表达。2、clcn3在不同发育阶段的斑马鱼存在表达,并有一定的组织分布规律;通过摸索,我们发现clcn3 Morpholino的最佳注射浓度为0.25 nmol/μl,且M2的注射效果最佳。注射后发现斑马鱼出现以下一些表型变化:心脏水肿、搏动频率减慢、造血功能障碍、身体发育短小、骨骼弯曲且活动力减弱等。颅颌骨的畸形主要包括:腹侧观舌骨小角排列成倒“V”形,且夹角增大;腮弓软骨呈“一”字形排列。严重者颅颌骨排列失去正常结构,且排列混乱;斑马鱼颅部的头尾径长度减小。背侧观颅部小梁发育左右不对称且变短。牙齿的主要变化为:斑马鱼的牙齿数量减少,多为一颗,且疏松地附着在第五腮弓软骨上。通过以上实验,我们发现CLC-3蛋白在小鼠牙胚以及不同发育阶段的斑马鱼表达,ClC-3氯通道基因缺陷可造成斑马鱼颅颌骨及牙齿的发育异常。ClC-3通过何种机制影响颌骨和牙的发育,我们将在后续试验中深入。