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目的:NIRF蛋白具有泛素连接酶的作用,课题组前期研究结果证实了NIRF在体外能够参与到HBV核心蛋白(HBc)的泛素化降解过程。为了探明NIRF基因在HBV引起的乙型肝炎进程中的作用,本课题对NIRF基因进行干预,在L02人正常肝细胞、HepG2人肝癌细胞及HepG2.2.15(2215)细胞中上/下调NIRF蛋白的表达,检测NIRF基因改变对上述细胞系增殖能力的影响,进一步探讨NIRF与HBV的关系。方法:1 Western Blot免疫印迹法分析NIRF蛋白在人L02正常肝细胞、人肝癌细胞株HepG2和2215细胞中的表达情况;2免疫细胞化学法检测2215细胞内NIRF蛋白与HBc蛋白的亚细胞定位情况;3运用PCR及人工合成DNA片段法分别构建NIRF真核表达载体及三组干扰载体Ri-1,Ri-2,Ri-3和阳性干扰质粒PC,将构建好的重组载体及空质粒对照用脂质体转染法转入2215细胞中,通过RT-PCR、Western Blot检测NIRF基因干扰情况,筛选出最有效的干扰载体;4将NIRF全长/干扰载体及相应空质粒对照用脂质体转染法转入上述肝细胞系中,通过流式细胞仪检测细胞周期和MTT法观察NIRF基因表达改变后对各细胞系细胞增殖活性影响的情况。结果:1通过Western Blot检测NIRF蛋白的表达,发现NIRF蛋白在HepG2.2.15细胞中表达量最高,L02正常肝细胞次之,HepG2肝癌细胞中表达量最低(P<0.01);2 NIRF和HBc在HepG2.2.15细胞中的定位显示:NIRF蛋白部分散在分布于细胞质中,其余大都呈颗粒状聚集在细胞核内。HBc的分布情况与NIRF分布类似,重叠后的图像显示HBc与部分NIRF具有共同的亚细胞定位;3利用电泳、PCR分析、DNA测序,经鉴定正确构建的干扰质粒转染2215细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测mRNA和蛋白表达水平,筛选出了具有最佳干扰效果的Ri-2质粒;4流式细胞周期结果显示,L02和2215细胞中NIRF的高表达会导致G1期阻滞,而HepG2细胞受其影响不明显;与此相反,NIRF的低表达对L02和2215细胞周期影响不明显,而HepG2细胞则显示为加速G1期向S期过渡促进DNA的合成。MTT结果显示,随着时间的延长,NIRF的高表达会抑制L02和HepG2细胞的增殖,低表达对细胞增殖活性没有明显影响;而在2215细胞中则表现为NIRF低表达极大地促进了细胞增殖(P<0.01),高表达对细胞增殖活性没有明显影响。结论:2215细胞中,NIRF蛋白的高表达且与HBc具有共同的亚细胞定位,表明了NIRF与HBV感染的个体细胞增殖与调控行为密切相关。进一步通过上、下调NIRF基因表达后发现,2215细胞的生物学行为与L02正常肝细胞和HepG2肝癌细胞完全相反。这很有可能是HBV结构基因对宿主细胞信号调控网络进行了干预导致的结果。本课题的开展为后期研究NIRF其他生物学功能及参与的信号通路奠定基础,期望探索更多NIRF基因在HBV引起的乙型肝炎中的作用,最终为乙型肝炎的临床治疗提供新见解。