柑橘是我国最主要的鲜销及加工水果之一,其色泽是最重要的果实品质之一,也是消费者选择时的重要依据。柑橘果实成熟过程中由绿转黄,涉及叶绿体/叶绿素降解与有色体/类胡萝卜素形成这两个过程,有研究发现自噬参与叶绿体降解并在其中发挥重要调控作用。本实验室前期滑皮金柑转录组数据分析发现:柑橘果实转色时期自噬基因表达量大幅上调,预示着细胞自噬可能参与叶绿体的降解,调控果实色泽品质的建立。然而目前针对植物的特有细胞器—叶绿体的选择性自噬研究较少,且主要集中于拟南芥等模式植物,果树领域对叶绿体的自噬研究更是一片空白。所以本研究拟从叶绿体自噬的角度出发探讨调控果实转色的分子机理。本研究从前期转录组数据中挑选出参与转色的候选自噬基因及有可能与其互作的叶绿体自噬受体,通过亚细胞共定位及BiFC等技术手段验证二者之间存在互作,暗示了叶绿体自噬可能参与柑橘果实转色。同时,考虑到柑橘生长周期过长以及转基因技术手段尚未成熟等因素,我们利用番茄稳定转化体系对自噬基因参与果实转色这一假设进行先一步的验证,结合显微成像技术与多种分子生物学手段,初步探索叶绿体自噬的分子机理,为调控柑橘果实色泽品质提供理论依据。主要研究结果如下:1.首次在柑橘材料中,鉴定并克隆了调控自噬的主要基因CitAtg5、CitAtg8a、CitAtg8c、FcrAtg8h、CitAtg12及CitAtg18,亚细胞定位结果显示这些自噬基因在细胞膜、细胞核、细胞质中均有定位,并在细胞质中标记一些自噬体样的点状结构,与之前的研究报道相符。2.通过对滑皮金柑转录组数据的分析发现,自噬基因FcrAtg8h与叶绿素酶基因FcrCLH的表达量在柑橘果实转色期大幅上调。相关蛋白序列分析显示FcrCLH含有多个AIM motif,将FcrAtg8h与FcrCLH瞬时共注射烟草分析其亚细胞共定位,结果表明,二者在叶绿体周边存在部分共定位。同时BiFC结果表明二者存在互作。3.构建番茄SIAtg5、SlAtg7、SlAtg8h超表达转基因材料,SlAtg8h-RNAi干涉材料及SlAtg8h-Crispr突变体材料。通过DNA阳检、qRT-PCR、DNA测序、荧光观察等多方面对转基因材料进行了筛选与验证。4.通过转基因材料表型的初步观察发现:在缺氮胁迫下,自噬超表达植株耐受性增强,其叶背及根系中积累大量花青苷;SlAtg8h-RNAi干涉植株表现出植株矮小、叶片与果实较野生型更绿、果实发育期延长,成熟延缓等多种表型。这表明Atg8h参与调控果实的生长发育和成熟转色,并在植物对逆境胁迫的响应过程中发挥重要调控作用。