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研究背景PAH(pulmonary arterial hypertension,肺动脉高压)是一种以肺血管阻力进行性增加,肺动脉压力逐渐升高的疾病,临床疗效及预后不佳。我们团队已应用腹腔内注射MCT(monocrotaline,野百合碱)成功建立PAH动物模型,用于PAH发病机制和疾病治疗研究。由于慢性PAH发展过程往往缓慢,而上述经典的一次性注射MCT诱导的大鼠PAH模型,存在病程偏急,动物生存期较短,生存率偏低的局限性。为此,我们拟建立一种新的PAH模型,以改善大鼠的生存期和生存率,也许更接近慢性的PAH过程。PAH的主要病理性改变包括肺血管重构和肺血管张力升高,其中PASMCs(pulmonary artery smooth muscle cells,肺动脉平滑肌细胞)的异常增殖和迁移在肺血管重构中起主导性作用,有些学者和我们前期的工作已经发现,PAH的发生发展中存在脂肪酸代谢异常,我们还发现脂肪酸代谢的关键酶CPT(carnitine palmitoyltransferase,肉碱棕榈酰转移酶)1在PAH大鼠的肺组织中表达增加。但CPT1在PASMCs增殖、迁移及PAH发生发展中具体的作用及机制不明。目的1.本研究力图在传统动物模型的基础上,建立更接近于慢性的PAH大鼠模型;2.观察CPT1在PAH大鼠肺血管中的表达,并探讨其在肺血管重构中的作用;3.研究CPT1及其调控信号通路分子的表达变化,并探索调控CPT1对PASMCs增殖和迁移的影响,及其改善肺血管重构的作用及其机制,为PAH治疗寻找新的靶点。方法1.PAH模型改良将130只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组,经典组和改良组。经典组,一次性腹腔内注射40mg/kg MCT以诱导建立PAH模型,改良组接受隔一周两次腹腔内注射20mg/kg MCT,对照组予以等量生理盐水腹腔注射。在首次MCT注射后第1、2、3、4周,以mPAP(mean pulmonary artery pressure,平均肺动脉压)、RVHI(right ventricular hypertrophy index,右心室肥厚指数)、肺血管重构肺小动脉WA%(wall area,横截面管壁面积占血管总面积的百分比)和WT%(wall thickness,管壁厚度占管径的百分比)、大鼠存活情况等为指标作为评价造模成功与否。存活大鼠的数量记录到第4周。2.动物体内实验按隔一周两次腹腔注射MCT 20mg/kg成功建立PAH大鼠模型后,处死取MCT2、4周后的肺组织检测相关指标,包括肺组织冰冻切片进行平滑肌特异性标志物α-SMA(α-smooth muscle actin,α平滑肌肌动蛋白)、CPT1单克隆抗体免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察CPT1在肺组织中的表达及定位情况,Western blot检测肺组织中CPT1、AMPK(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,腺苷酸活化蛋白激酶)、p-AMPK(phospho-AMPK,磷酸化的AMPK)、p53和p21及PCNA的表达情况,非放射法检测肺组织CPT1活性,化学发光法检测ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)生成情况等。3.体外细胞实验自雄性清洁级SD大鼠取肺动脉分离培养原代PASMCs,对其进行平滑肌特异性标志物α-SMA抗体检测鉴定。CPT1单克隆抗体及线粒体标志物Mito Tracker染色,激光共聚焦显微镜观察鉴定PASMCs及确定细胞内CPT1的表达定位。PASMCs饥饿培养24h后,分别加入PDGF(platelet derived growth factor,血小板源性生长因子)-BB和CPT1的不可逆抑制剂Etomoxir进行干预实验,同时制备CPT1a过表达慢病毒,感染PASMCs上调CPT1的表达。在24和48h后,MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测PASMCs增殖情况,化学发光法检测ATP生成情况,Western blot检测CPT1、p-AMPK/AMPK、p53、p21表达情况,应用非放射法检测细胞CPT1活性,流式细胞仪测定细胞周期。4.统计分析数据以平均值±标准差((?)±s)表示,计数资料以百分比表示。使用t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)和双因素方差分析(two-way ANOVA)来检验差异,随后用成对比较进行SNK-q检验。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析得出存活曲线,并使用对数秩检验进行比较,以P<0.05定义为差异有显著性统计学意义。所有数据均采用SPSS 13.0软件系统进行统计学分析。结果1.PAH模型改良首次MCT注射后4周,mPAP(经典组34.48±2.36mmHg,改良组31.58±2.69mmHg比对照组17.30±3.10mmHg;P<0.05),RVHI(经典组53.68±5.70%,改良组45.07±11.21%比对照组25.73±6.04%;P<0.05),WA%(经典组80.57±3.92,改良组80.49±7.63比对照组47.03±6.95;P<0.05),WT%(经典组58.50±3.27,改良组56.33±6.87比对照组28.21±3.94;P<0.05)在经典组和改良组中均高于对照组。与经典组相比,改良组mPAP和RVHI较低(P<0.05)。MCT注射后4周,改良组存活率高于经典组(改良组78.57%比经典组57.14%;P=0.027,n=22)。2.动物体内实验肺组织的免疫荧光染色结果显示,2周和4周的PAH大鼠肺动脉平滑肌肌层均明显增厚,肺血管发生重构。CPT1在大鼠肺组织中均有表达,PAH大鼠肺组织中肺血管CPT1表达较正常大鼠增多。MCT首次注射后4周时CPT1的表达水平稍低于2周,但仍高于对照组水平。在PAH进展过程中大鼠肺组织CPT1酶活性升高,ATP表达增多,但2周和4周差异不明显。PAH进展过程中磷酸化AMPK、p53和p21的表达均有下降,其中磷酸化AMPK和p53在2周时即有明显下降,4周时继续下降则不明显,而p21则在2周时下降不明显,4周时显著下降。此外,Western blot的结果还显示,随PAH的进展,肺组织中PDGF及PCNA的表达水平逐渐升高,差异具有统计学意义。3.体外细胞实验成功分离培养SD大鼠PASMCs,α-SMA染色鉴定后,确定分离的细胞为平滑肌细胞。免疫细胞荧光染色发现,CPT1能在PASMCs中表达,并定位于线粒体。PDGF-BB干预可上调CPT1的表达,呈浓度和时间依赖性,促进细胞增殖。PDGF-BB同时能够促进ATP的生成,抑制AMPK的磷酸化,降低p53和p21的表达,细胞周期G0/G1期比例减少,G2/M比例增加,这些作用能被CPT1抑制剂Etomoxir部分逆转。而过表达CPT1则能够促进PASMCs增殖,促进ATP的生成,抑制AMPK的磷酸化,上调p21和p53的表达水平。并且发现,Etomoxir能够抑制PASMCs的迁移。结论1.通过MCT 20mg/kg隔一周两次腹腔内注射给药能成功建立PAH大鼠模型,其存活率较传统一次性40mg/kg给药方法高,更接近人类慢性的PAH病程,是一种更理想的PAH大鼠模型;2.CPT1可促进PASMCs异常增殖与迁移,这可能导致肺动脉高压的发生发展;3.CPT1可通过AMPK-p53-p21途径调控PASMCs增殖。