逆境胁迫是目前农业生产面临的严峻问题之一，影响作物生长发育，导致产量和品质降低。植物即使生长在适宜条件下，在进行呼吸和光合电子传递时也会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。盐渍、干旱、极端温度、臭氧等非生物胁迫均可以导致ROS大量产生，若未及时清除，ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤，进而导致细胞及组织死亡。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一，环境胁迫下叶绿体内产生的ROS的快速清除有助于保护光合机构，维持植物光合功能。抗坏血酸（ascorbate，AsA）是叶绿体活性氧清除系统的关键组分，在胁迫条件下叶绿体AsA因迅速氧化而损失。叶绿体单脱氢抗坏血酸还原酶（chloroplasticmonodehyedroascorbate reductase，chlMDAR）是叶绿体AsA再生的关键酶，它还原单脱氢抗坏血酸再生出AsA，从而维持叶绿体AsA水平。因此，研究MDAR基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。　　 本研究从番茄叶片克隆了番茄叶绿体单脱氢抗坏血酸还原酶基因（LeMDAR），并对该基因的表达和功能进行了分析。　　 1.利用同源序列设计兼并引物，通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体MDAR基因的中间片段，通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段，拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeMDAR（DQ665255）。该基因全长为1940bp，ORF为1449 bp，编码483个氨基酸，分子量约为53 kDa。同源序列比较发现，番茄叶绿体单脱氢抗坏血酸还原酶基因的序列与菠菜、拟南芥、甘蓝、芥菜、马蹄莲、海榄雌和胡黄连的MDAR基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LeMDAR有三个序列保守的结构域，domainⅠ和domainⅡ是FAD或NAD（P）H的ADP结合区域，domainⅢ是FAD的黄素的结合区域。　　 2.将p35S-LeMDAR-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合，说明LeMDAR基因产物定位于叶绿体。　　 3.Northern杂交分析表明，LeMDAR基因在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时该基因的表达受低温、高温、盐、干旱等胁迫诱导，其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。　　 4.将获得的LeMDAR基因与含有35S启动子的pBI121载体重组，分别构建了正义和反义表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测，结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型植株相比，过表达LeMDAR基因的番茄叶片MDAR活性和AsA含量增加，脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量下降，AsA还原状态高于野生型。LeMDAR基因表达发生沉默的番茄植株中MDAR活性和AsA含量降低，DHA含量增加，AsA的还原状态显著低于野生型。　　 5.构建了原核表达载体pET-LeMDAR，并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，将诱导带切下，溶于PBS获得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效价为1:500。Western杂交表明，转正义基因植株中LeMDAR基因已在蛋白水平过量表达，但是转反义基因植株LeMDAR基因的表达明显受到抑制。　　 6.正常生长条件下，野生型与转正义、反义基因植株生长量无明显差别。但是，温度和NaCl胁迫条件下，转正义基因番茄幼苗生长量明显高于野生型，而转反义基因植株生长明显受到抑制，过表达LeMDAR基因提高了番茄植株的抗逆能力。　　 7.在低温弱光（4℃，100μmol m-2s-1）和高温（40℃）胁迫条件下，野生型和转基因株系的净光合速率（Pn）和PSII最大光化学效率（Fv/Fm）下降，但与野生型相比，转正义基因株系S17和S4的下降缓慢，而转反义基因株系A14和A1的下降更为明显。这表明LeMDAR的过表达减轻了PSII的光抑制程度，与野生型相比，转正义基因植株PSII反应中心受伤害较轻，而转反义基因番茄的PSII反应中心受伤害较重。在低温弱光处理过程中转基因植株与野生型的氧化态P700降低，恢复48 h后，转正义基因植株S17和S4分别恢复到原来的96.0％和93.3％，而野生型和转反义基因植株A14和A1分别恢复到原来的82.8％，73.5％和71.6％。经过24 h处理，转基因和野生型的H2O2和丙二醛含量均增加，转反义基因植株显著高于野生型，但是转正义基因植株增加不明显。　　 8.分别用50μM和100μM甲基紫精（Methyl viologen，MV）处理野生型与转基因番茄叶圆片24 h，与野生型相比，转正义基因番茄叶圆片有少的失绿；转反义基因植株失绿非常严重，几乎看不到绿色。与之相对应，转正义基因植株叶圆片有较高的叶绿素含量，其次是野生型叶圆片，而转反义基因植株叶圆片的叶绿素含量极低。这表明过表达TeMDAR提高了番茄抗甲基紫精诱导的氧化胁迫的能力。　　 用100μM MV处理后，转基因和野生型番茄叶片的净光合速率（Pn）均下降，但转反义基因植株Pn下降更明显，处理24 h后S17、S4、WT、A14和A1的Pn分别下降了27.5％、34.3％、52.1％、64.0％和70.6％。同时，PSII最大光化学效率（Fv/Fm）也下降，但是下降不如光合速率明显。MV处理24 h后，野生型和转基因番茄H2O2显著增加，转反义基因植株中H2O2增加到未处理时的3倍。MV处理过程中，与野生型相比，转正义基因植株抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性相对稳定，降低较少，但是转反义基因植株APX活性显著降低。这些结果表明，过表达LeMDAR提高了番茄AsA含量，维持了APX的活性，保护光合机构，使转正义基因番茄具有更强的抗氧化胁迫能力。　　 9.200 mM NaCl和20％（w/v）PEG-6000处理下，与野生型相比，转正义转基因表现出高的Pn和低的H2O2水平。渗透胁迫下，转正义基因植株Fv/Fm降低的程度显著低于野生型。而反义转基因株系对NaCl和PEG处理最为敏感。　　 10.定点突变分析表明，LeMDAR的117位Cys对维持MDAR的活性和结构稳定生具有重要的作用。